小麥旗葉寬主效QTL QFlw-5B遺傳效應解析

劉朦朦，張萌娜， 張倩倩，劉錫建，郭宇航，孫靳惠，武亞瑞，王素容，吳永振，孫 晗，崔 法，趙春華

(魯東大學農學院,山東煙臺 264025)

作物干物質積累和產量形成的基礎是光合作用，葉片是作物光合作用的主要器官[1-2]。旗葉是小麥生長后期光合效率最高的葉片，對光合作用的貢獻率占全部葉片光合作用貢獻率總和的 45%～58%[3-4]。旗葉的光合產物是小麥籽粒碳水化合物的重要來源[5]，提供了籽粒灌漿所需碳水化合物總量的 41%～43%[6]，對小麥籽粒產量的貢獻可達 1/3[7]，在籽粒和產量形成中起著重要的作用。旗葉性狀主要包括旗葉長、旗葉寬和旗葉面積。旗葉性狀對小麥產量影響很大，旗葉寬的影響顯著高于旗葉長和旗葉面積，旗葉越寬，葉片氣孔導度及胞間CO2濃度越大，越有利于氣體交換的進行和CO2的供應[8]。小麥旗葉寬度與籽粒硬度等品質性狀呈極顯著正相關[9]。因此挖掘與旗葉寬相關的優異等位基因，開發分子標記，進一步開展分子標記輔助選擇育種，將大大加快小麥優異品種的選育進程，為小麥產量性狀分子育種提供優異基因資源和選擇工具。

小麥旗葉寬是受多基因控制的數量性狀，遺傳基礎復雜。隨著分子生物學和生物統計的發展，以分子標記遺傳圖譜和各種統計模型為基礎的數量性狀位點(quantitative trait loci,QTL)作圖技術，為研究數量性狀遺傳提供了有效的技術手段[10]。目前，國內外有關旗葉性狀的QTL 研究已有諸多報道，Nalini等[11]確定了 25個關于旗葉長、旗葉寬和稈長的QTL；Fan等[12]在 8個環境中檢測到控制旗葉長、旗葉寬和旗葉面積的共 38個QTL；Wu等[13]在 4個環境中檢測到 11個有關旗葉寬的QTL；Hussain等[14]在4個環境中檢測到控制旗葉長、旗葉寬和旗葉面積的 30個QTL；Zhao等[15]在 4個環境中共檢測到 31個有關旗葉長、旗葉寬和旗葉面積的QTL；逯臘虎等[16]在小麥第四部分同源群上定位出 3個有關旗葉寬穩定表達的主效QTL。但目前對于旗葉性狀遺傳效應解析的報道并不多見。

本課題組利用科農 9204與京 411構建的重組自交系群體(KJ-RILs)在5B染色體上定位了一個控制旗葉寬的主效QTLQFlw-5B[12]。本研究在其基礎上利用SNP標記進一步對QFlw-5B靶區段染色體進行加密，構建高密度遺傳圖譜，進而對QFlw-5B進行定位，以期找出與其緊密連鎖的分子標記并進行單倍型分析，明確其在育種上的應用，為品種的遺傳改良提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為科農 9204、京 411及其 188個家系組成的重組自交系群體(KJ-RIL)，由中國科學院遺傳與發育生物學研究所農業資源研究中心李俊明研究員課題組提供。田間種植包括 8個環境，分別為 2011-2012年石家莊高氮環境(E1)，2011-2012年石家莊低氮環境(E2)，2012-2013年石家莊高氮環境(E3)，2012-2013年石家莊低氮環境(E4)，2012-2013年北京高氮環境(E5)，2012-2013年北京低氮環境(E6)，2012-2013年新鄉高氮環境(E7)，2012-2013年新鄉低氮環境(E8)，其相關性狀調查參照Fan等[12]的方法。310份育成品種(系)由本課題組收集和保存，其中包含 197份審定品種，詳見附表1。

1.2 QFlw-5B靶區段定位

結合前期QFlw-5B旗葉寬QTL定位結果[12]及靶區段分子標記探針信息[17]，通過BLAST將靶區段分子標記錨定于中國春參考基因組IWGSC RefSeq v1.0。利用完備區間作圖[18]軟件IciMapping v4.1(http://www.isbreeding.net/)和MapQTL 6.0對旗葉寬QTLQFlw-5B作進一步定位。

1.3 基因型掃描及數據處理

采用 SDS-酚法[19]從植株幼葉中提取DNA。利用小麥55K Affymetrix 芯片對 310份育成品種(系)組成的自然群體進行基因型鑒定，由北京康普森生物技術有限公司(http://www.kangpusen.com/)雜交分型獲得相關探針對應材料的基因型。利用NCBI進行BLAST分析(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/release/)，將每個SNP探針側翼序列與中國春的參考基因組IWGSC RefSeq v1.0進行比對，以明確SNP對應的物理位置。結合310份自然群體基因型鑒定結果，在靶區段內確定3個標記AX-111065169(5B595513567)、AX-110922298(5B596618615)和AX-110913121(5B598056157)進行自然群體的單倍型分析。其中，優異單倍型為AAA，非優異單倍型為BBB，重組型為AAB、ABB、 BAA和BAB，雜合型為ABH、 AHA、 AHB、 AHH、 HAA、 BAH、 HAB、 HAH、 HBB和BHB。

2 結果與分析

2.1 QFlw-5B靶區段高密度遺傳連鎖圖譜構建結果

在原圖譜基礎上[12]，構建高密度遺傳連鎖圖譜，5B染色體新加密SNP標記 5 938個[20]，進一步縮小了QFlw-5B靶區段的置信區間。圖1為5B靶區段染色體分子標記加密之前低密度連鎖圖譜和加密之后高密度連鎖圖譜的比較，加密后圖譜明顯縮小了標記間的平均遺傳距離。

圖1 QFlw-5B靶區段高密度遺傳連鎖圖譜及 QFlw-5B加密前后位置比較(加密前區間為80～110 cM，加密后區間為65～69 cM)

2.2 QFlw-5B在高密度遺傳圖譜的定位

利用兩個軟件(IciMapping 4.1 和 MapQTL 6.0)對QFlw-5B在高密度圖譜上進行進一步定位，兩個軟件均在 7個環境中(E1除外)檢測到在5BL染色體上的AX-110978403～AX-111671812區間內有1個控制旗葉寬的主效QTL，LOD峰值也出現在此區間的61.22～68.60 cM遺傳距離范圍內，LOD值為4.05～8.81(表1)，能夠解釋9.40%～19.76%的旗葉寬表型變異，來自科農 9204的等位基因增加旗葉寬 0.04～0.07 cm。

表1 基于高密度遺傳圖譜7個環境下 QFlw-5B的定位結果Table 1 Location of QFlw-5Bin seven environments based on high-density genetic map

2.3 QFlw-5B對產量性狀的遺傳效應

基于QFlw-5B緊密連鎖標記(LOD峰值下標記) AX-108884656對 188個KJ-RIL 進行基因型分組，結合其 8個環境下產量相關性狀表型數據進行方差分析，結果(圖2)表明，來自科農 9204的優異等位基因相對于京 411等位基因在增加旗葉寬的同時，8個環境下均能夠增加穗粒數，且對穗粒數的影響在E7下達到極顯著水平(P<0.01)。優異等位基因在 6個環境下能增加千粒重(E2和E8除外)和單株產量(E4和E5除外)，平均單株產量增加 1.31%，而對單株穗數有一定的負效應。

2.4 QFlw-5B靶區段在育成品種中的遺傳解析

2.4.1QFlw-5B靶區段單倍型分析

根據 310份育成品種(系)的芯片分析及SNP的物理位置信息，在QFlw-5B靶區間選取 3個SNP 標記AX-111065169、AX-110922298和AX-110913121對310份育成品種(系)進行單倍型分析，靶區段優異單倍型(科農 9204基因型，AAA)所占比例為 16.13%；非優異單倍型(京 411基因型，BBB)所占比例為 7.10%；重組型個體占 57.74 %；靶區段處于雜合狀態的材料占 10.32 %(表2)。

2.4.2QFlw-5B靶區段單倍型在不同省份的選擇效應分析

在271個育成品種(系)(表3)中，青海省含QFlw-5B靶區段優異單倍型的品種占其品種總數的比例最高，為 35%，重組型也占35%；其次是河南省，含QFlw-5B靶區段優異單倍型的品種占32%，重組型占42%；河北省材料中，含靶區段優異單倍型的品種占 22%，重組型占 69%；四川省材料中，含靶區段優異單倍型的品種占20%，重組型占 57%；北京市材料中，含靶區段優異單倍型的品種占 5%，重組型品種占 50%；山東省材料中，含靶區段優異單倍型品種占 5%，重組型品種占 79%。西藏，安徽省、云南省、陜西省、山西省、內蒙古自治區和甘肅省等省份的材料由于數量過少，在這里不做統計分析。

AAA:等位基因來自科農9204的KJ-RIL；BBB：等位基因來自京411的KJ-RIL； **：AAA與BBB在E7環境下差異極顯著(P<0.01)。

AAA: KJ-RIL containing the allele derives from Kenong 9204; BBB: KJ-RIL containing the allele derives from Jing 411; **: The differences between AAA and BBB are significant under E7(P<0.01).

圖2QFlw-5B對產量性狀的遺傳效應

Fig.2 Genetic effect ofQFlw-5Bon yield related traits

表2 310份高代育成品種(系)的 QFlw-5B單倍型分析Table 2 Haplotype analysis of QFlw-5Bin the 310 high generation varieties(lines)

優異單倍型為AAA；非優異單倍型為BBB；重組型包括AAB、ABB、BAA和BAB；雜合型包括ABH、AHA、AHB、AHH、HAA、BAH、HAB、HAH、HBB和BHB。表3同。

The excellent haplotype is AAA; The non-excellent haplotype is BBB; The recombinant type include AAB,ABB,BAA and BAB; The heterozygous type include ABH,AHA,AHB,AHH,HAA,BAH,HAB,HAH,HBB and BHB.The same in table 3.

2.4.3 含QFlw-5B優異單倍型的品種

對 310個品種(系)中的 45個含QFlw-5B優異單倍型的品種按省份來源分析(表4)。其中，青海省和河南省含有優異單倍型的品種最多，都為 12個品種；其次是四川省，有9個含優異單倍型的品種；山東省材料中，優異單倍型品種為 6個；河北省材料中，優異單倍型品種為 5個；北京市材料中只有 1個優異單倍型品種。可見，大多數省份材料中優異單倍型的個數均較少。

3 討 論

在本研究中，QFlw-5B靶區段錨定到5BL物理圖譜上，對應于5B:594145232～602570956的物理區間。在前人的研究中，Edae等[21]在5B:576921577的物理位置附近檢測到與穗粒數相關的QTL。Wang[22]和 Golabadi[23]在5B:577086664的物理位置附近，檢測到與千粒重、穗粒重相關的QTL[22-23]。Zhang等[24]在5B:61984378～5B:634179670的物理區間內檢測到與千粒重相關的QTL。Liu等[25]在5B:598031683的物理位置附近檢測到與穗粒重相關的QTL。可見，靶區段附近存在與產量性狀相關的QTL位點。

本研究中，利用與QFlw-5B緊密連鎖分子標記對產量相關性狀進行了分析，發現增加旗葉寬的標記同時對穗粒數、千粒重和單株產量有一定的增效作用，對單株穗數有一定的負效應，這與Zhao等[15]研究結果一致，因此在小麥育種中應對寬旗葉的材料進行適當的選擇。

表3 不同省份品種(系)的 QFlw-5B 單倍型分析Table 3 Haplotype analysis of QFlw-5Bin varieties(lines) from different provinces

表4 含 QFlw-5B 優異單倍型的品種(系)Table 4 Varieties(lines) of QFlw-5Bexcellent haplotype

QFlw-5B靶區段在 310份小麥育成品種(系)中的單倍型分析表明優異單倍型在育種材料中已得到選擇，但選擇程度在不同省份各有差異。QFlw-5B靶區段優異單倍型在源于青海省和河南省的材料中占比較高，表明QFlw-5B靶區段優異單倍型在青海春麥、冬麥及河南冬麥育種中已被育種家優先選擇，但是在源自北京市和山東省的材料中，QFlw-5B靶區段優異單倍型占比較低，僅為 5%，表明QFlw-5B靶區段優異單倍型在黃淮冬麥區育種中還未被育種家選擇。而重組型品種在所有省份中所占比例均較高，表明小麥旗葉寬改良還有很大空間。