腸道病毒71型致病機制及免疫反應研究進展

施梅言 ， 陸彩霞 ，代解杰

（中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心，昆明 650118）

腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）是單股正鏈小RNA病毒，無包膜，屬于腸道病毒科腸道病毒屬，是正二十面體顆粒。EV71核酸長約7.4 kb，兩端分別為5'-UTR和3'-UTR，中間是單一的開放閱讀框，可編碼多聚蛋白；而多聚蛋白可被宿主和病毒蛋白酶水解，可產生4個病毒衣殼結構蛋白V P 1～V P 4和7個非結構蛋白（2A～2C，3A～3D），其中VP1、VP2、VP3 暴露于病毒衣殼的外側，VP4包埋于內側，抗原決定簇基本位于VP1～VP3[1]。EV71是引起手足口病（hand, foot and mouth disease，HFMD）的主要病原體之一。HFMD主要發生在5歲以下兒童[2]，可通過呼吸道、消化道和密切接觸傳播。EV71感染引起的HFMD，除了手足口癥狀外，還能導致神經系統疾病，如神經源性肺水腫、腦干腦炎、無菌性腦膜炎、急性弛緩性麻痹等，嚴重威脅兒童的生命健康安全[3]。我國自1981年在上海發現HFMD以后，北京、河北等十幾個省均有報道，香港地區1987年發生過EV71流行；1998年我國臺灣省發生EV71引起的感染疾病和皰疹性咽頰炎暴發流行，在6月和10月兩波流行中，共監測到129 106例，其中重癥患者405例，死亡78例，死亡病例大多為5歲以下的兒童[4]。自2008年開始HFMD發病率呈逐年上升趨勢，2013～2014年增長速度最快，達到70.03/10萬[5]。然而，目前關于EV71如何入侵神經系統的致病機制尚不明確。本文就EV71的致病機制及免疫反應研究進展進行綜述，為今后EV71重癥患者的救治和疫苗及藥物的研發提供理論依據。

1 致病機制

EV71入侵人體后，若機體未產生足夠抗體清除病毒，病毒隨血液循環導致第一次病毒血癥。若機體免疫力差，EV71入侵淋巴結、肝、脾、骨髓等靶器官，經血液循環，引發嚴重病變，臨床表現為脊髓灰質炎、腦炎、無菌性腦膜炎、神經源性肺水腫、急性弛緩性麻痹或心肌炎等[6-7]，其中以腦組織病變最為嚴重，提示EV71可能由血腦屏障進入神經系統，或通過周圍神經的軸突由逆向軸漿的方式進入。重癥HFMD患者病情發展迅猛，甚至導致死亡。有研究表明，部分成人感染EV71后可通過接觸傳播將病毒傳染給兒童使其致病[8]。

1.1 EV71感染對神經系統的致病機制

目前HFMD動物模型主要包括BALB/c小鼠模型、ICR小鼠模型、免疫缺陷小鼠模型、中緬樹鼩模型及獼猴模型等。Caine等[9]成功建立了免疫缺陷小鼠模型，并通過腹腔注射途徑感染時小鼠出現神經系統病變，表現為肢體癱瘓和死亡，在其腸道和中樞神經系統中均能檢測到病毒蛋白。EV71感染的重癥患者中，發現腦組織病變最為嚴重。李軍等[10]通過EV71感染小鼠模型發現，EV71存在中樞神經系統的病變部位，提示EV71可直接造成中樞神經系統（CNS）損傷。Lin等[11]通過對EV71感染死亡患兒的尸解發現，腦膜表面有中性粒細胞浸潤，腦實質有大范圍中性粒細胞，神經元細胞壞死，腦干和脊髓嚴重受累。郝博等[12]通過尸檢在感染者CNS中發現EV71及炎癥存在。Khong等[13]通過口服途徑感染小鼠時，缺乏外源性抗體的AG129小鼠出現肢體癱瘓和死亡，腸道感染和口腔感染的中樞神經系統均檢測到病毒蛋白。Liou 等[14]通過EV71感染雜交小鼠時出現了肢體癱瘓，但在肌肉中沒有檢測到病毒RNA或蛋白質，僅在中腦和脊髓等中樞神經系統中顯示出高密度的病毒蛋白，這表明癱瘓僅僅是由中樞神經系統損傷引起的，而不是肌炎和肌肉破壞。有學者[15-16]推測EV71侵入機體后可能通過逆向軸突運輸途徑累及CNS，這可能與EV71具有嗜神經性及病毒衣殼蛋白有關。Fu等[17]通過小鼠實驗也證實，神經通路的逆行軸突運輸可能是EV71累及CNS的主要方式。病毒感染后激發機體免疫反應，釋放多種細胞因子，形成“風暴”引起全身炎性反應，導致多臟器功能衰竭。患者的CD4、CD8、T細胞和自然殺傷（NK）細胞耗竭。在腦干腦炎患兒中，神經系統炎性反應伴有白細胞介素10（IL-10）、 IL-13 和干擾素-γ（IFN-γ）產生以及淋巴細胞損耗，導致機體的免疫功能下降，病情加重。因此，對EV71致病機制的深入探索有利于重癥患者的治療。

1.2 EV71感染對神經源性肺水腫的致病機制

Dong等[18]通過靜脈、呼吸道途徑感染3～3.5歲獼猴，成功建立了EV71獼猴模型，均能引起中樞神經、呼吸系統明顯的病理改變，表現為肺氣腫、肺出血、神經元損傷和炎性細胞浸潤等特點。神經源性肺水腫是HFMD患兒死亡的主要原因之一，神經源性肺水腫的發生是一個復雜的病理生理過程，主要與CNS 損傷后神經因素、體液因素、生物活性因子等有關。動物實驗和病理檢查發現，EV71 感染的肺組織表現為肺部充血水腫并伴有局灶性出血，并且從中未分離到EV71 病原體，另外心臟組織病理檢查無明顯炎性改變，結合肺水腫發生過程中伴有神經性尿潴留、腸麻痹、多汗、失眠和心動過速等自主神經功能失調表現，推測EV71 感染后的肺水腫是神經源性[19]。王文廣等[20]采用滴鼻、灌胃等途徑感染中緬樹鼩，成功制備了HFMD模型并出現與人類相似的癥狀，如心、肺、腸、脾和腎等部位出現組織變性壞死、水腫、炎性細胞浸潤等病理改變。楊坤等[21]研究認為，EV71感染后所致神經源性肺水腫的發病機制可能是EV71入侵CNS后并發腦干腦炎，造成視丘下部和延髓孤束核功能紊亂，機體的應激反應導致交感神經興奮，血中兒茶酚胺（腎上腺素、去甲腎上腺素等）含量顯著增高，進而全身血管收縮，血流動力學急劇變化，動脈血壓急劇增高，體循環內大量血液進入肺循環；一方面肺毛細血管床有效濾過壓急劇增高，大量體液滯留在肺組織間隙，從而形成肺水腫；另一方面血流沖擊造成血管內皮細胞損傷，同時體內血管活性物質（如組織胺和緩激肽等）大量釋放，使血管通透性增加，大量血漿蛋白外滲，導致急性肺水腫進一步加重。

Liao等[22]發現用EV71感染小鼠時，會產生一些炎性因子，如IL-6、IL-10和IFN-γ。Chen等[23]研究發現，EV71重癥患者中被感染的免疫細胞可使促炎因子大量釋放，而促炎因子也與肺水腫有關。人類樹突狀細胞會在病毒感染的條件下釋放促炎因子IL-6、IL-12 和腫瘤壞死因子α（TNFα）[24]，也可誘使人類T細胞、巨噬細胞和人類單核細胞產生促炎因子，如TNFα和巨噬細胞遷移抑制因子[25]。Jin等[26]建立了EV71感染的小鼠模型，發現EV71感染后，小鼠的大腦、肺和骨骼肌中均可見肥大細胞的積累、激活和過敏性炎癥，在小鼠的肺中IL-4、IL-5、IL-13和TNFα水平升高。細胞因子“風暴”的發生對機體的免疫耐受產生嚴重的影響，也是引起EV71重癥患者死亡的重要原因。EV71入侵機體后，首先破壞腦干中具有特定功能的調節結構，引發神經功能紊亂，最終導致神經源性肺水腫的發生。因此，對重癥患者的細胞因子水平進行嚴密監測，有助于患者治療，進一步降低EV71的致死率。

2 EV71感染引起的固有免疫反應

固有免疫是機體抵御病毒入侵的第一道防線，病毒入侵后，會被模式識別受體（patternrecognition receptors，PRR）如Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLR）、維甲酸誘導的基因Ⅰ樣受體[retinoid acid-inducible geneⅠ（RIG-Ⅰ）-like receptors，RLR]識別，激活固有免疫系統，使其產生促細胞因子和Ⅰ型干擾素，對病毒進行抵御和清除。Lei等[27]研究發現，當EV71重癥感染時，Ⅰ型干擾素缺失，而其他細胞因子水平異常增高，這表明固有免疫反應失衡。Khong等[13]發現，免疫缺陷的AG129小鼠缺乏Ⅰ型和Ⅱ型干擾素受體時，可通過腹腔注射和口服途徑感染非小鼠適應的EV71，受感染的小鼠在死亡前表現出肢體癱瘓。越來越多的病毒感染致病機制研究表明，機體的固有免疫應答具有抵抗病毒感染的能力，是通過活化PRR通路，產生干擾素，PRR（包括TLR和RIG-Ⅰ）通過識別不同途徑的病毒核酸，招募特異接頭蛋白，激活一系列信號級聯反應，引發Ⅰ型干擾素和促炎因子的產生。研究表明，IFN-α的表達能顯著降低EV71的感染率。

固有免疫的調控需要免疫細胞的參與，包括吞噬細胞、NK細胞、自然殺傷T（NKT）細胞、γδT細胞和 B1 細胞等。在EV71 重癥患者的血清和腦脊液中能夠檢測到包括IL-6、IL-10、IL-13、TNFα、IL-1β和IL-8 等在內的大量炎性因子和趨化因子的異常增高[28-32]。TLR和RLR通過對病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）的識別，觸發下游固有免疫，激活相關信號通路，主要包括絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、核轉錄因子κB（NF-κB）、TANK 結合蛋白激酶1-干擾素調節因子3信號通路和激活蛋白1（activator protein 1，AP-1）信號通路[33]。EV71感染時，在激酶活化下，TAK1結合蛋白1（TAK1-binding protein 1，TAB1） 能夠使I κB激酶（I κB kinase，IKK）復合物磷酸化，最后激活 NF-κB和AP-1，兩者均可調控前炎性因子的基因轉錄過程[34]，同時產生IL-6、IL-8 和 IL-1β及相關炎性因子，抵御EV71感染。研究表明，當EV71入侵時，TLR3 通過招募干擾素誘導型含TIR結構域的接頭分子（TRIF），經泛素化激活下游信號轉化生長因子活化激酶1（TAK1），繼而使IKKα、IKKβ磷酸化，最終活化 NF-κB，從而介導 MyD88 非依賴性信號通路[35]，誘導細胞因子及干擾素的表達，從而抑制EV71的復制。

Meng 等[36]研究發現，在 EV71 輕癥、重癥感染患者和健康對照人群的外周血單核細胞（P B M C）中，有8 5 4 1個長鏈非編碼R N A（lncRNA）發生差異表達變化，其中大量lncRNA與固有免疫和炎性反應密切相關，提示lncRNA在EV71感染固有免疫調控過程中也可能扮演重要角色。研究 EV71 感染與其觸發的固有免疫反應之間的相互作用機制，尋找EV71致病過程中關鍵的宿主分子或病毒蛋白等作為靶標，對疫苗和藥物的研發有積極的推動作用。近年來研究取得了一定的進展，如Liao等[37]采用小鼠適應EV71株（MP4）感染的7日齡ICR小鼠模型，探討二甲胺四環素治療EV71感染的抗炎抗病毒作用，發現二甲胺四環素降低了細胞病理效應（C P E s）、病毒蛋白表達、病毒滴度、I L-6和IL-8的水平，證明二甲胺四環素在感染和炎癥神經系統疾病模型中具有抗炎和免疫調節特性；另有研究[38]發現，以 NF-κB 通路為作用靶點可以抑制 EV71的復制。近年來，隨著EV71感染固有免疫反應調控研究的不斷深入，人們對免疫調控有了更深入的認識，為今后深入研究EV71感染引起的固有免疫反應提供了新思路。

3 EV71感染引起的適應性免疫

病毒入侵機體后，可誘發機體產生適應性免疫，包括T細胞介導的細胞免疫與B細胞介導的體液免疫，主要依靠特異性T細胞活化發揮免疫效應，以及依靠B細胞產生特異性的抗體發揮免疫效應，達到清除病毒的目的。有研究發現，在感染前或感染后對小鼠注射一種EV71特異性中和抗體，可以在B細胞缺乏的C57BL/6來源小鼠中顯著降低小鼠致死率和組織中的病毒載量[11]。T細胞膜表面有100多種特異性抗原，兩群輔助性T細胞（T h）克隆均能誘導抗原提呈細胞（A P C）表達主要組織相容性復合體（M H C）Ⅱ類抗原，T h 1通過I F N-γ誘導巨噬細胞（macrophages，Mφ）表達Ia抗原，而Th2通過IL-4對Mφ和B細胞Ia抗原表達起正調節作用，對抗病毒免疫應答進行調節[39]。細胞毒性T細胞表面表達CD8，這類細胞可以通過MHC Ⅰ類抗原直接結合識別內源性抗原，對靶細胞產生直接殺傷作用，進行病毒清除。

劉莉等[40]研究表明，感染 EV71可通過凋亡引起 NK 細胞、CD3+T細胞等淋巴細胞減少，對機體免疫反應產生抑制作用。B細胞不僅表達MHC Ⅰ類抗原，而且表達較高密度的MHCⅡ類抗原，B細胞表面的MHCⅡ類抗原在B細胞與T細胞相互協作時起重要作用，此外，還參與B細胞作為輔佐細胞的抗原提呈作用。B細胞表面的CD40與T細胞表面的CD40L交聯，能誘導B細胞免疫應答，促進細胞因子釋放。Johnson等[41]研究表明，缺乏IFN的AG129小鼠，也能產生有效的體液和細胞免疫。據報道，濾泡輔助性T細胞（一種新的CD4+T細胞亞群Tfh），在抗體產生過程中發揮著重要的作用，其主要功能是輔助B細胞增殖、分化，繼而參與到抗體產生及體液免疫應答[42]。有研究表明，Th1 向 Th2 細胞轉變，從而產生免疫抑制效果，同時也是促進HFMD發展的重要機制之一[43]。Imura等[44]發現，用甲醛溶液滅活的EV71皮下接種免疫成年轉基因小鼠，該疫苗在免疫小鼠中誘導了足夠水平的中和抗體，大多數免疫小鼠存活，無臨床癥狀或組織病理學損傷，免疫小鼠的病毒復制明顯低于未免疫小鼠。總之，固有免疫和適應性免疫在EV71感染過程中被激活時，二者通過協同作用對病毒進行清除，兩者密不可分，互相影響。

4 免疫原性

預防性疫苗的研發是控制EV71感染引起HFMD最有效的方法，目前中國醫學科學院醫學生物學研究所（IMBCAMS）和北京科興生物制品有限公司（Inovac）研發的EV71滅活疫苗已經實現量產。免疫原性研究疫苗的種類包括滅活疫苗、桿狀病毒表達的病毒樣顆粒（VLP）疫苗和大腸埃希菌表達的VP1亞單位疫苗，評價模型一般選擇小鼠、獼猴等動物。

EV71滅活疫苗通常選擇毒力較高的毒株作為疫苗候選株，具有良好的免疫原性及遺傳穩定性，并在動物實驗中具有交叉保護作用。EV71疫苗原液的免疫原性要顯著低于鋁佐劑疫苗[45]，目前進入臨床的滅活疫苗均使用鋁作為疫苗佐劑。Bek等[46]對用C4a亞型毒株制備的2種滅活疫苗進行小鼠攻毒保護研究，結果顯示，小鼠接種2種疫苗3~5周后均產生高滴度的 IgG抗體以及針對C4和B3亞型毒株的中和抗體。此外，子鼠可抵御 B3 亞型 EV71 攻擊病毒株（MP-26M）的攻擊。但部分中和抗體滴度較低的母鼠產生的子代乳鼠也可在攻毒后得以存活，故認為除中和抗體外，體液免疫應答的調節功能在動物保護中也可能發揮了重要作用。Chou等[47]用甲醛溶液滅活的EV71毒株免疫小鼠可引起高水平的病毒特異性抗體，具有交叉中和活性，并保護免疫的宿主對抗病毒EV71在小鼠模型中的致死性攻擊。

EV71滅活疫苗在動物實驗中具有良好的免疫原性，為臨床試驗階段的研究提供了重要的依據。通過桿狀病毒表達系統表達的 VLP可誘導小鼠產生體液免疫和細胞免疫，對小鼠有一定的保護能力，但是還缺乏VLP 交叉保護的研究[48]。Foo等[49]通過研究EV71的T細胞和B細胞表位，并成功從VP1中鑒定出3個表位，且實驗結果證實這3個表位均可以促進CD4+T細胞的分化，產生大量的IL-2和IFN-γ。Lin 等[50]應用制備的 VLP疫苗免疫獼猴，結果顯示，VLP疫苗和 EV71 滅活病毒均可誘生大量的抗 EV71 抗體，且均可誘導T 細胞和 B 細胞應答，但VLP 疫苗誘導的中和抗體滴度低于 EV71 滅活病毒組，可能是VLP中VP1的構象與天然病毒有差異。雖然獼猴對EV71疫苗產生抗體反應，與在人類身上觀察到的類似，但是它們不適合研究神經毒力和肺水腫并發癥，并且它們的使用受到倫理和經濟的限制[51]。VP1是中和表位的主要聚集區，具有作為抗病毒亞單位疫苗的潛力，動物實驗結果表明此類重組VP1亞單位疫苗具有一定的免疫原性[52-55]，且大腸埃希菌中表達的VP1蛋白融合完全佐劑能在小鼠體內誘導中和抗體效應，增強輔助T細胞增殖，誘導產生高水平的IL-10和IFN-γ，對小鼠有一定保護作用。Liu等[56]研究發現，用EV71截短肽生成的候選融合蛋白疫苗免疫可以保護小鼠免受致命性EV71的感染。以上研究為HFMD安全性疫苗的研發奠定了基礎。

5 展望

近年來，關于EV71致病機制及免疫反應方面的研究已經取得了一定進展。這些研究從EV71逃逸干擾素反應、EV71 抑制NF-κB 信號通路、EV71與天然免疫細胞相互作用等方面對EV71與宿主固有免疫系統之間的關系進行了深入剖析。同時，EV71的免疫調控過程也受到宿主RNA表達譜的影響；部分研究還揭示了EV71致病過程中關鍵的宿主分子或病毒蛋白等靶標，這對疫苗和藥物的研發有積極推動作用。

雖然目前對EV71的研究已經取得了很大進展，但EV71感染重癥患者的免疫失衡機制以及致弛緩神經系統麻痹機制等問題未完全闡明。展望未來，今后關于EV71的研究熱點和方向主要是EV71的致病機制及其與宿主細胞的免疫反應機制，對這些問題的闡釋有助于為EV71重癥患者有效藥物的研發提供理論基礎。