鐵死亡與肝臟疾病

李運淇，嚴文靜，王 雯*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)2017級四年制醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專業(yè)，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京 100069)

1 鐵的代謝

1.1 鐵的吸收與利用

鐵是體內(nèi)一種必需的微量元素。機體從食物中獲取的鐵主要為Fe3+，其在胃酸或十二指腸上皮細胞膜中的細胞色素b(D-cytb)的作用下被還原為Fe2+。隨后Fe2+通過二價金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白(divalent metal transporter 1，DMT1)被十二指腸和空腸吸收進入小腸上皮細胞內(nèi)[1]。在小腸上皮細胞基底膜的鐵轉(zhuǎn)運蛋白(ferroportin 1，F(xiàn)PN1)和膜鐵轉(zhuǎn)運輔助蛋白(hephaestin，HP)的介導(dǎo)下，F(xiàn)e2+被氧化成Fe3+，并被轉(zhuǎn)運到血液中，F(xiàn)e3+進而與轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，Trf)結(jié)合通過血液循環(huán)供給其它組織器官利用[2]。與Trf結(jié)合的Fe3+在轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor 1，TfR1)的介導(dǎo)下通過胞吞的方式被攝入到細胞內(nèi)，并儲存于鐵蛋白(ferritin)中，以供細胞正常的生理活動之用。

1.2 鐵穩(wěn)態(tài)代謝的分子調(diào)控機制

體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)對于鐵的吸收與利用起著至關(guān)重要的作用。細胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)受鐵調(diào)節(jié)蛋白(iron-regulatory proteins，IRPs)-鐵反應(yīng)元件(iron-responsive element，IRE)的調(diào)節(jié)，而系統(tǒng)性鐵穩(wěn)態(tài)受鐵調(diào)素(hepcidin)-FPN軸的調(diào)控。IRPs通過與鐵蛋白和FPN1的mRNA結(jié)合，從而對細胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)進行調(diào)節(jié)。hepcidin是肝細胞分泌的成熟激素肽，可以調(diào)控小腸上皮細胞對鐵的攝取以及巨噬細胞對鐵的釋放，從而對體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)進行調(diào)控。鐵蛋白對于細胞內(nèi)鐵的貯存和利用尤為重要。在哺乳動物細胞中，鐵蛋白組裝成大分子配合物，具有可容納多達4 500個鐵原子的腔室，在細胞內(nèi)具有調(diào)節(jié)鐵的生物利用度和解毒的作用。

2 鐵死亡及其在肝臟疾病中的作用

2.1 鐵死亡是鐵依賴性的新型細胞死亡方式

鐵死亡(ferroptosis)是由Stockwell等人在2012年首次提出的一種鐵依賴性的新型細胞死亡方式[3]。鐵死亡發(fā)生的分子機制主要是基于芬頓反應(yīng)，在此反應(yīng)中，細胞內(nèi)游離的Fe2+與H2O2發(fā)生反應(yīng)生成Fe3+，并使得多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)發(fā)生脂質(zhì)過氧化，最終介導(dǎo)生物膜發(fā)生氧化損傷，促使細胞死亡。最近有研究發(fā)現(xiàn)輔酶Q10(CoQ10)會捕獲介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化作用的脂質(zhì)過氧化自由基，而鐵死亡抑制蛋白1(ferroptosis suppressor protein 1，F(xiàn)SP1)作為一種氧化還原酶，能夠通過還原CoQ10抑制脂質(zhì)過氧化[4]。FSP1獨立于GPX4谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase 4，GPX4)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，可以抑制鐵死亡的發(fā)生[4]。鐵死亡的形態(tài)特征是線粒體體積縮小、外膜破裂、線粒嵴減少或消失[5]；其生化特點表現(xiàn)為細胞內(nèi)鐵和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的大量積累，產(chǎn)生過度的氧化應(yīng)激以及膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[6]。

2.2 鐵死亡機制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子

胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運體(system Xc-)在鐵死亡中起著關(guān)鍵的作用。system Xc-主要介導(dǎo)細胞外的胱氨酸轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)，同時排出細胞內(nèi)的谷氨酸。隨后，胱氨酸可以轉(zhuǎn)化為半胱氨酸，用于內(nèi)源性抗氧化劑GSH的合成。最后，GPX4利用GSH清除細胞內(nèi)過量的ROS，減少毒性脂質(zhì)過氧化物(L-OOH)的含量，并將其轉(zhuǎn)化成無毒脂醇(L-OH)。Erastin(Ⅰ型鐵死亡激活劑，system Xc-抑制劑)和RSL3(Ⅱ型鐵死亡激活劑，GPX4抑制劑)可以激活鐵死亡的發(fā)生。近年來一些鐵死亡抑制劑也相繼被發(fā)現(xiàn)。Ferrostatin-1(Fer-1)和Liproxstatins可以抑制脂質(zhì)過氧化并減少ROS的產(chǎn)生；包括去鐵胺(deferoxamine，DFO)在內(nèi)的諸多鐵螯合劑可以抑制芬頓反應(yīng)，減少細胞內(nèi)ROS的生成，抑制脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，進而抑制鐵死亡的發(fā)生。此外，鐵蛋白也是一種重要的鐵死亡負向調(diào)控因子。由于細胞衰老使得細胞內(nèi)鐵蛋白降解受到抑制，鐵蛋白大量積聚，可使得細胞對鐵死亡的敏感性下降[7]。

2.3 鐵死亡與肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)

HCC是肝癌中最為常見的一種，在全球男性癌癥死亡率中居于第二。索拉非尼是一種多激酶抑制劑，也是第一種用于治療晚期HCC的藥物，并且可以顯著延長HCC患者的生存期，索拉非尼可以通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和鐵死亡等方式促使癌細胞死亡，并且這種死亡方式可被鐵死亡抑制劑Fer-1完全阻斷[8]。因此，索拉非尼可以誘導(dǎo)肝癌細胞發(fā)生鐵死亡，從而起到治療HCC的作用。

在肝癌細胞發(fā)生鐵死亡的過程中，p62-Keap1-NRF2通路起著關(guān)鍵作用。目前p62-Keap1-NRF2對HCC中鐵死亡的具體調(diào)節(jié)機制已被闡明[9]：當(dāng)細胞癌變時，p62可以通過調(diào)節(jié)Keap1降解，激活NRF2轉(zhuǎn)入核內(nèi)；進而激活下游調(diào)節(jié)鐵和ROS代謝相關(guān)基因的表達，抑制鐵死亡的發(fā)生。此外，NRF2還通過胱硫醚酶途徑誘導(dǎo)促進鐵死亡的重要負向調(diào)節(jié)因子金屬硫蛋白(MT1G)的表達，導(dǎo)致癌細胞對索拉非尼耐藥[10]。

視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)蛋白是真核細胞中調(diào)節(jié)各種基因轉(zhuǎn)錄功能的蛋白家族的成員，在多種癌癥中為一種腫瘤抑制蛋白，其與肝腫瘤的發(fā)生和肝癌細胞鐵死亡的發(fā)生均密切相關(guān)。有研究表明，索拉非尼刺激下，RB蛋白表達水平降低的HCC細胞死亡率是RB蛋白表達水平正常細胞的2～3倍，這表明RB蛋白表達水平降低的HCC細胞對索拉非尼誘導(dǎo)的鐵死亡更加敏感[11]。此外，RB蛋白的失活可通過增加線粒體中ROS的產(chǎn)生，進而增強了細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，而這可能是RB蛋白調(diào)節(jié)肝癌細胞鐵死亡的關(guān)鍵機制[11]。因此，鐵死亡可能是治療HCC的一種新策略，而NRF2和RB蛋白可能是未來治療HCC的關(guān)鍵靶點。

2.4 鐵死亡與肝纖維化(liver fibrosis)

肝臟纖維化是多種病因所致的慢性肝臟損傷后發(fā)生的肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生性疾病，長期發(fā)展會導(dǎo)致肝硬化，是常見的致死病因之一。目前，除肝臟移植外，針對肝纖維化及肝硬化尚缺乏有效的治療措施。星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活是肝纖維化形成的基礎(chǔ)之一，在肝損傷因素的驅(qū)動下，靜止的肝星狀細胞轉(zhuǎn)分化為能夠產(chǎn)生基質(zhì)的成纖維細胞，隨后導(dǎo)致肝纖維化。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡與肝纖維化有著密切的聯(lián)系，在肝纖維化大鼠模型中，異甘草酸鎂(MgIG)治療可顯著減輕肝臟損傷并減少纖維化瘢痕形成[12]。MgIG可以通過促進鐵和脂質(zhì)過氧化物的積累而誘導(dǎo)HSC發(fā)生鐵死亡，從而起到抗纖維化的作用；而通過Fer-1抑制HSC鐵死亡則完全消除了MgIG的抗纖維化作用[12]。同樣有研究證實RNA結(jié)合蛋白(ELAVL1/HuR或ZFP36/TTP)介導(dǎo)的HSC鐵死亡需要通過HSC中的自噬信號傳導(dǎo)途徑(鐵蛋白自噬)來調(diào)節(jié)，上調(diào)ELAVL1和下調(diào)ZFP36可以促進索拉非尼誘導(dǎo)的HSC鐵死亡，從而改善小鼠肝纖維化[13-14]。

最近的一項研究表明肝臟Trf通過調(diào)控鐵死亡可以抑制肝臟損傷、纖維化及肝硬化發(fā)生[15]。研究人員構(gòu)建了肝細胞Trf基因敲除小鼠(Trf-LKO)模型以及肝細胞Trf基因和Slc39a14基因雙敲除小鼠(DKO)模型，并發(fā)現(xiàn)Trf-LKO小鼠表現(xiàn)為肝臟非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵(non-transferrin-bound iron，NTBI)蓄積以及肝纖維化的病理特征，而雙敲小鼠可顯著減少肝臟NTBI的蓄積，從而減少由高鐵飲食或CCl4注射引起的鐵死亡以及肝臟纖維化。以上結(jié)果充分闡明了肝臟Trf缺乏通過鐵死亡促發(fā)肝纖維化的分子機制，明確了Slc39a14是組織器官鐵離子過載的轉(zhuǎn)運蛋白，并且為肝臟纖維化的治療提供了新的靶點。

2.5 鐵死亡與酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)

ALD是以肝脂肪變性、脂肪性肝炎和肝纖維化為特征的一種肝臟疾病，也是目前全世界主要的健康隱患之一，其對肝臟的損傷最終可能發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。乙醇在肝臟的代謝過程中會產(chǎn)生大量活性極高的乙醛、脂肪酸乙酯、磷脂酰乙醇和ROS。這些代謝產(chǎn)物可以阻礙細胞正常的生理功能，如蛋白質(zhì)穩(wěn)定、脂肪生成、線粒體呼吸和氧化還原平衡，導(dǎo)致肝細胞死亡。有研究[16]報道肝臟鐵超載與ALD有關(guān)，其主要機制是長期大量飲酒可降低肝臟中hepcidin的表達，進而可通過增加十二指腸DMT1和FPN表達從而增加十二指腸對鐵的吸收。Sirtuin1(SIRT1)是一種組蛋白去乙酰化酶，可通過修飾組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)脂質(zhì)的代謝。經(jīng)長期乙醇喂養(yǎng)后，與對照組(即野生型)小鼠相比，腸道SIRT1缺失(SIRT1iKO)的小鼠的肝臟損傷和肝臟炎癥顯著減輕。SIRT1iKO小鼠的這種保護作用可能是由于減輕鐵代謝功能障礙，提高GSH含量，減輕脂質(zhì)過氧化而造成的[17]。此外，在脂肪特異性脂質(zhì)-1過表達的酒精性脂肪性肝炎小鼠(Lpin1-Tg)模型中，Lpin1-Tg小鼠表現(xiàn)出脂肪變性、炎癥增強、肝膽侵犯性損傷和肝纖維化。乙醇喂養(yǎng)Lpin1-Tg小鼠則表現(xiàn)為更為嚴重的肝炎和大量鐵積累、鐵分布異常、谷胱甘肽水平降低、MDA水平升高并引起脂質(zhì)過氧化[18]。這些結(jié)果都表明鐵死亡在ALD中發(fā)揮關(guān)鍵作用，同時也為探索ALD的發(fā)病機制提供了新的思路。

2.6 鐵死亡與非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)

目前，NAFLD已成為全世界慢性肝病和HCC的主要原因。NAFLD包括單純性肝脂肪變性以及非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)，其特征是肝細胞中脂滴的積累、細胞死亡以及免疫/炎性細胞浸潤和一定程度的纖維化。有研究[19]發(fā)現(xiàn)一些NASH患者表現(xiàn)為肝臟鐵積聚，這種由代謝異常引起的鐵積累可能會加劇NASH的進程，而服用維生素E治療后可以抑制NASH患者的脂質(zhì)過氧化并降低血清轉(zhuǎn)氨酶水平，減少肝脂肪變性，從而改善NASH。在蛋氨酸/膽堿缺乏飲食(MCD)誘導(dǎo)的NASH小鼠模型中，給予RSL3后發(fā)現(xiàn)肝臟脂肪變性有所加劇，而給予用亞硒酸鈉(GPX4激活劑)、DFO或Fer-1治療，NASH嚴重程度顯著降低[20]。此外，NASH患者血清鐵蛋白水平升高與疾病嚴重程度有關(guān)，并且血清鐵蛋白是NAFLD患者晚期肝纖維化的獨立預(yù)測因子[21]。最近有研究表明，在缺乏膽堿、補充乙硫氨酸(CDE)飲食的NASH小鼠模型中，鐵死亡是引發(fā)NASH的先發(fā)事件，并且鐵死亡的發(fā)生先于其它類型的細胞死亡[22]。兩種鐵死亡抑制劑奎諾二甲基丙烯酸酯(Trolox)和去鐵銅(deferiprone，DFP)可抑制此模型鼠肝臟細胞的鐵死亡，并抑制了隨后的免疫細胞浸潤和炎癥反應(yīng)[22]。以上研究結(jié)論均證實了NAFLD與鐵死亡的發(fā)生有關(guān)，并且對鐵死亡的抑制將可能成為治療NAFLD的新方案。

2.7 鐵死亡和藥物引起的肝損傷(drug-induced liver damage，DILI)

DILI是急性肝功能衰竭(acute liver failure，ALF)的主要病因，對乙酰氨基酚(APAP)則是最為常見的引發(fā)ALF的藥物。APAP在細胞色素p450的作用下產(chǎn)生高反應(yīng)性和高毒性的代謝產(chǎn)物N-乙酰基-對-苯醌亞胺(NAPQI)，從而引起對肝臟的毒性，GSH可以與NAPQI結(jié)合進而排毒。因此過量服用APAP后，肝中會生成大量的NAPQI，進而造成GSH的耗竭。如前文所述，GSH對于鐵死亡的發(fā)生起著至關(guān)重要的作用，因此這也暗示鐵死亡可能參與到APAP引起的肝損傷。

在最近的一項研究中，APAP處理的小鼠原代肝細胞接受Fer-1治療后細胞存活率提高[23]。由于Fer-1對CYP2E1(細胞色素P450同工酶)沒有影響，因此可以推斷其對APAP誘導(dǎo)細胞死亡的保護作用與鐵死亡相關(guān)途徑被抑制有關(guān)[23]。同樣有研究進一步發(fā)現(xiàn)Fer-1和DFO可以通過抑制脂質(zhì)過氧化和GSH耗竭而降低APAP誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠的死亡率[24]。以上研究結(jié)果均表明鐵死亡參與了DILI，并提示通過藥物抑制鐵死亡有可能成為臨床治療DILI的新策略。

3 結(jié) 語

除上述疾病外，鐵死亡已被證實還與其它多種肝臟疾病有著密切的聯(lián)系，如肝臟缺血再灌注損傷、病毒性肝炎和免疫介導(dǎo)的肝炎，以及瘧原蟲感染等。鐵死亡通過產(chǎn)生ROS和脂質(zhì)過氧化作用影響疾病的發(fā)生與發(fā)展，因此抑制鐵死亡可用于預(yù)防和保護由于氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和免疫原性介導(dǎo)的各種肝損傷，而誘導(dǎo)鐵死亡可用于治療耐藥的惡性腫瘤和肝纖維化等肝臟疾病。

作為近年來新發(fā)現(xiàn)的一種鐵依賴性細胞死亡方式，鐵死亡的調(diào)節(jié)機制及其在一些肝臟疾病中的確切作用仍未完全闡明，而且目前仍沒有檢測鐵死亡的特異性標(biāo)記物。因此，對于鐵死亡特異性標(biāo)記物以及新的鐵死亡激活劑、抑制劑的研發(fā)至關(guān)重要。鐵死亡的確切作用似乎還與細胞類型和疾病背景有關(guān)，而從實驗動物獲得的結(jié)果能否可以順利地轉(zhuǎn)化為人類病理生理學(xué)的研究尚待闡明。因此，建立各種與鐵死亡相關(guān)的肝臟疾病的實驗動物模型將有利于進一步研究鐵死亡在人類肝臟疾病中發(fā)揮的作用。綜上所述，明確肝臟細胞鐵死亡的具體機制將有助于理解各種肝臟疾病的發(fā)病機制，并為這些疾病的臨床治療提供新的策略。