血小板反應蛋白1與缺血性卒中

崔柳平， 馬 迪， 陳 盈綜述， 邢英琦審校

新生血管是導致動脈粥樣硬化斑塊破裂的重要原因，斑塊破裂后出血，血小板聚集到病變處形成血栓，加重腦血管狹窄；此外，大動脈粥樣硬化病變脫落的栓子可堵塞遠端腦血管。腦組織對缺血性卒中的急性反應是復雜的。首先，活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加引起氧化應激，氧化應激在缺血性卒中及腦缺血再灌注損傷的發病機制中起著至關重要的作用，ROS通過上調炎癥介質和激活基質金屬蛋白酶引起血腦屏障破壞；血腦屏障的破壞促進免疫細胞向腦組織遷移[1]。缺血性卒中發作后數分鐘至數小時，遷移到腦組織的免疫細胞和腦組織中的小膠質細胞活化引發一系列炎癥反應[2]；缺血后導致繼發性腦損傷和神經元死亡，產生炎性介質，進一步擴大炎癥反應。最新觀點認為，缺血性卒中后腦內炎癥不會局限于缺血灶周圍，而會向全腦擴散并長期存在，持久的全腦炎癥可能會導致慢性神經退行性變并影響卒中后的全腦功能[3，4]。近年來越來越多的文獻報道，僅保存神經元可能不足以治療卒中，最佳的卒中療法應包括神經血管單位中所有細胞類型之間的功能相互作用[5]，包括神經元、血管系統和神經膠質成分，針對氧化應激、炎癥反應以及膠質細胞的修復進行綜合治療。

已經證實，發生缺血性卒中后血小板反應蛋白1(thrombospondin-1，TSP-1)水平升高，是預測缺血性卒中不良預后的獨立預測因子[6]，而且TSP-1影響氧化應激、炎癥反應以及星形膠質細胞對神經元的修復作用，TSP-1在缺血性卒中以及神經損傷中起重要作用。

1 血小板反應蛋白1的結構及功能

TSP-1由三條多肽鏈組成，通過二硫鍵相連，是一種總分子量接近450 kDa同源三聚體糖蛋白；最初在血小板α顆粒中被發現，在激活時從血小板釋放；后發現它存在于許多細胞類型，如內皮細胞、血管平滑肌細胞和免疫細胞(包括巨噬細胞和T細胞)等。TSP-1分泌到細胞外發揮作用，通過多種細胞表面受體(例如整合素、CD36、CD47、肝素硫酸蛋白聚糖、低密度脂蛋白相關蛋白和極低密度脂蛋白受體)與細胞相互作用而調節細胞功能，對血管生成、細胞增殖、趨化粘附、遷移存活、神經元修復和免疫調節發揮多種作用[7，8]。

TSP-1在生理情況下表達量極低，在病理情況下被誘導表達；其對微環境變化敏感，可即時改變其表達水平。TSP-1的表達水平受眾多因素影響，如應激條件(熱休克或缺氧)使其上調；TSP-1 在mRNA和蛋白水平受多肽生長因子上調，同時受p53腫瘤抑制基因產物表達水平的調節；TSP-1在蛋白水平被白介素-lβ 或腫瘤壞死因子α下調[9]。

2 血小板反應蛋白1與動脈粥樣硬化性缺血性卒中

2.1 血小板反應蛋白1與血管反應 易損斑塊的特征是薄纖維帽和大脂質壞死核心以及新生血管形成；而易損斑塊傾向于破裂，隨后發生出血、血栓形成等事件與新生血管的形成密切相關。腦血管局部形成動脈粥樣硬化斑塊或者其他部位的易損斑塊脫落的栓子堵塞腦血管都是缺血性卒中的重要原因。在病理狀態下，血管內皮細胞功能障礙，對血液成分的黏附能力改變，血管管徑改變，對組織器官產生不利影響。大動脈和微血管研究均證實TSP-1表達水平增高在血管病理中的負面作用[8]。

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是經典的促血管生成因子，在新生血管生成中起關鍵作用；VEGF /eNOS/NO/sGC/cGMP信號轉導途徑控制血小板和炎性細胞的聚集和粘附、血管舒張及收縮功能，此通路受阻與缺血性卒中、局部缺血再灌注損傷等疾病密不可分[10]。VEGF可刺激eNOS(內皮源性一氧化氮合酶)的磷酸化，而TSP-1可以直接結合VEGF，從而抑制血管生成；TSP-1還可以與CD47結合抑制VEGF誘導血管內皮生長因子2酪氨酸激酶活化的能力，從而抑制Src(酪氨酸激酶)和Akt(蘇氨酸激酶)的活化，降低eNOS活性使NO信號傳導受阻[11，12]。TSP-1與 CD47結合抑制了基礎的和NO刺激的sGC(可溶性鳥苷酸環化酶)活化；在內皮細胞中，TSP-1通過抑制VEGF減少cGMP(環鳥苷一磷酸)的生成，同時TSP-1與CD47結合抑制cGMP依賴性蛋白激酶(cGK)的下游信號傳導。TSP-1抑制信號通路VEGF /eNOS/NO/sGC/cGMP的各個環節，使局灶性缺血后腦血流量減少、血小板和炎性細胞黏附增加，促進組織損傷[10，12，13]。

雖然TSP-1可以抑制新生血管生成，但TSP-1以及其與CD47結合對VEGF /eNOS/NO/sGC/cGMP信號通路的抑制作用遠大于其益處；在嚴重的組織缺血模型中，與僅使用一氧化氮前體藥物治療相比，用CD47拮抗劑抗體與一氧化氮前體藥物共同治療，使組織存活率提高了100%[10]。

2.2 血小板反應蛋白1與氧化應激 大量的實驗證據表明氧化應激與線粒體功能障礙有關，缺血性卒中損傷的標志之一是線粒體功能障礙[14]，線粒體產生ROS、調節NLRP3(模式識別受體家族中Nod樣受體域蛋白)炎癥激活促進缺血性卒中的進展，線粒體動力學(如裂變，融合和轉移)在缺血性卒中后的發展中具有關鍵作用；同時，ROS可導致線粒體呼吸受損和線粒體自噬增加，最終導致線粒體功能障礙，影響炎癥反應和凋亡過程。ROS引發涉及許多細胞因子和信號通路的復雜病理過程，減少ROS產生對于缺血后細胞存活和神經系統改善至關重要[15，16]。

當TSP-1與細胞表面受體CD47 結合時，會導致線粒體二價鈣離子水平升高和線粒體膜電位水平降低，引起線粒體功能障礙；此外，兩者結合激活PKC(蛋白激酶C)以及Nox亞基P47phox的磷酸化以Nox-1(氮氧化物)依賴方式刺激血管平滑肌產生超氧陰離子[17，18]。人腦內皮細胞是血腦屏障的主要組成部分，不僅在細胞基質信號傳導中起重要作用，而且還分泌神經元營養因子，在缺血性卒中中，血腦屏障和內皮穩態很重要。體外建立的腦內皮細胞氧化應激模型，TSP-1響應氧化應激而積極產生，CD47通過與TSP-1結合，上調細胞間黏附分子1和血管細胞黏附分子1，促進周圍白細胞的粘附和遷移，激活凝血功能系統和血腦屏障破壞[19，20]。抑制TSP-1和CD 47的結合，可減輕氧化應激，改善中樞神經系統功能。

有文獻報道，TSP-1在胰島B細胞中可通過激活核因子紅系2相關因子2(Nrf2)信號可起到氧化應激防御作用[21]。Nrf2是一種基本的亮氨酸拉鏈蛋白，在氧化應激下，Nrf2易位至核，調節內源性抗氧化劑蛋白質，從而防止氧化損傷。缺血性卒中小鼠模型中，激活Nrf2可啟動內源性抗氧化劑程序，小鼠的神經功能缺損得到改善，梗死面積減少以及與腦水腫相關的缺血后損傷減輕[22～24]，但是 TSP-1是否在腦組織中激活Nrf2發揮氧化應激防御作用值得進一步研究。

2.3 血小板反應蛋白1與炎癥反應 許多研究發現，小膠質細胞和單核細胞/巨噬細胞會發揮吞噬清除功能，但也會增加斑塊不穩定性，參與血栓形成。循環單核細胞通過內皮細胞遷移到腦實質中，小膠質細胞是中樞神經系統中的常駐免疫細胞，在組織損傷期轉化為活化的巨噬細胞；小膠質細胞與循環中單核細胞衍生的巨噬細胞相似，激活后分化為經典的促炎表型和替代的抗炎表型，除了吞噬因腦損傷引起的細胞碎片外，還產生多種神經營養因子和免疫調節因子參與調節大腦的重塑和修復。在卒中的不同階段觀察到小膠質細胞的雙重作用，小膠質細胞和巨噬細胞吞噬清除死亡神經元，促進腦部炎癥的消退；受微環境中細胞因子的調節，隨著病變進展，小膠質細胞和巨噬細胞由最初的抗炎表型逐漸轉化促炎表型[1，25～27]。在缺血性卒中的慢性期，活化的小膠質細胞廣泛分布是卒中后全腦炎癥的一個突出特征。星形膠質細胞是大腦中最豐富的神經膠質細胞，在正常的生理條件下為神經元提供營養支持，并調節突觸活動；在缺血性卒中發生后，星形膠質細胞也被激活，活化的星形膠質細胞釋放多種促炎因子，促進炎癥反應，加重腦組織損傷[26]。

NF-κB(核轉錄因子)是經典的炎癥反應轉錄因子，是缺血性卒中炎癥反應的主要參與者，其可通過低氧、ROS和幾種炎癥介質來激活；同時，它可以調節多種促炎因子產生，包括白介素6、白介素1β和腫瘤壞死因子α。動物實驗已經證實，NF-κB途徑的選擇性抑制，可以減輕大鼠的腦缺血再灌注損傷，下調腦組織炎性細胞因子，減少缺血引起的神經元凋亡，減輕血腦屏障破壞，改善神經功能并減輕其腦水腫和梗死面積；NF-κB的選擇性抑制還可以抑制星形膠質細胞活化，隨后下調星形膠質細胞釋放的趨化因子減少腦組織繼發性炎癥損傷。此外，抑制TLR4 /NF-κB途徑的激活可以降低NLRP3炎性體成分的表達，阻斷促炎型小膠質細胞的極化。在對巨噬細胞的研究中，TSP-1通過NF-κB信號通路促進炎癥性細胞因子的表達，也通過激活TLR4(Toll樣受體4) /NF-κB途徑刺激巨噬細胞產生腫瘤壞死因子α。抑制 TSP-1可能會抑制免疫細胞的活化和促炎因子的產生[28～31]。

JAK2(Janus激酶2) / STAT3(信號傳導及轉錄活化因子3)信號通路是缺血性卒中后被激活的另一引發炎癥反應的途徑，抑制JAK 2/ STAT3通路可以降低基質金屬蛋白酶的表達，減少神經炎癥和細胞凋亡，并改善急性缺血性卒中的血腦屏障完整性[32，33]。TSP-1對JAK2/ STAT3通路作用的研究僅限制于結腸炎，TSP-1衍生肽能夠抑制結腸組織中STAT3的活化，有效控制結腸炎癥和血管生成[34，35]。TSP-1是否對在腦組織中激活的JAK2 / STAT3途徑具有抑制作用還有待進一步研究。

炎癥和血栓形成是相互影響的兩個過程，急性缺血性卒中患者的血小板以高度活化的狀態存在，活化的血小板與單核細胞相互作用觸發炎癥反應，活化的單核細胞能夠通過獨立于經典的血小板粘附機制捕獲不受刺激的血小板，通過產生組織因子促進凝血酶生成，激活血小板[36]。TSP-1作為血小板與活化單核細胞的黏著性連接分子，可促進局部血栓形成。因此，減少TSP-1 表達，抑制單核細胞和血小板的活化，不僅可以減少血小板分泌TSP-1，還可以抑制血栓形成。

2.4 血小板反應蛋白1與星形膠質細胞 在缺血性卒中發生后，缺血性損傷會導致廣泛的樹突棘丟失，棘突的丟失可能會導致功能改變，樹突棘是否恢復取決于局部缺血的嚴重程度[37]，早日解除局部缺血和促進新的突觸形成是卒中治療的目標，樹突棘的恢復可改善卒中后的神經系統功能。

TSP-1對eNOS/NO/sGC/cGMP信號途徑的抑制作用會限制卒中后的組織再灌注[38]；而在缺血性損傷的恢復階段，神經元釋放尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)，星形膠質細胞將uPA受體募集到其質膜，uPA與星形細胞uPAR(uPA受體)的結合激活ERK1 / 2(細胞外信號調節激酶1/2)介導的STAT3途徑，STAT3直接與TSP-1啟動子結合從而使TSP-1蛋白水平的升高，參與突觸可塑功能[39，40]。星形膠質細胞不僅參與了炎癥反應，對突觸的修復更是起到了關鍵作用；而星形膠質細胞產生的TSP-1一方面參與局部組織缺血過程，一方面有助于突觸修復。無論對缺血性卒中的發展有利還是有害，TSP-1都參與其中，因此需要進一步研究TSP-1在缺血性損傷中的突觸形成潛力是否超過其負面調節作用。

3 TSP-1作為缺血性卒中治療靶點的潛力

TSP-1作為細胞基質蛋白，能夠與細胞表面多種受體結合，參與多種信號通路發揮作用；其參與動脈粥樣硬化性缺血性卒中病理過程，可能是治療的新的研究方向。TSP-1缺乏可減少與肥胖相關的炎癥以及巨噬細胞的遷移、黏附和炎癥信號；巨噬細胞源性的TSP-1與CD47相互作用可刺激主動脈瘤中巨噬細胞募集和炎癥發生，調節單核細胞的遷移和黏附，促進主動脈瘤的發展[41]；當敲除CD47時，可觀察到脊髓損傷后炎癥減少[37]；與此相一致，在肝移植缺血再灌注的研究中，阻斷TSP-1/CD47 使其對NO/cGMP信號傳導的抑制作用消失，并且減少了再灌注組織中中性粒細胞和巨噬細胞的浸潤，促炎細胞因子的分泌以及ROS的產生[42]，缺血性卒中同樣存在缺血再灌注過程，并且在預后較差的患者血清中TSP-1濃度較高，因此阻斷TSP-1與CD47的結合可能對缺血性卒中同樣有益。

4 展 望

缺血性卒中發生的兩大主要原因是(1)在局部的動脈粥樣硬化病變促進血小板黏附、聚集和釋放，最終形成血栓；(2)大動脈的粥樣硬化斑塊碎片或者破裂、出血，形成的栓子脫落堵塞腦小血管。動脈粥樣硬化病變的病理過程以及缺血性卒中進展過程，都包括氧化應激、炎癥反應和血管反應。現臨床上使用的調脂、抗血小板和營養神經等藥物在單個方面治療缺血性卒中；而TSP-1對血管生成及血管舒張、免疫細胞激活、活性氧的產生以及突觸的修復都有影響，開發TSP-1拮抗劑或者其受體CD47的拮抗劑用于治療缺血性卒中可能使患者受益更多。