5-HT 對形覺剝奪成年大鼠視皮層神經傳遞的影響

□王嬌嬌 許錦秀 劉向玲 許彤（.新鄉醫學院三全學院 河南 新鄉 453003；.新鄉醫學院第二附屬醫院 河南 新鄉 45300）

弱視是指視覺發育敏感期內不正常的形覺體驗造成的視力障礙，Maya 等人研究發現成年弱視大鼠長期應用氟西汀，可明顯逆轉眼優勢柱轉移和促進視功能恢復，但其作用機制不明，而這對成人弱視的治療至關重要。因此， 本研究以長時程增強（long-term potentiation，LTP）為研究指標，擬用電生理學方法探討5-羥色胺鹽酸鹽對單眼形覺剝奪性成年弱視大鼠離體腦片視皮層LTP 的影響，觀察5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）在成年弱視大鼠雙側視皮層神經傳遞中的作用， 為臨床治療成人弱視提供一定理論依據。

1、材料和方法

1.1、材料

5-羥色胺鹽酸鹽（美國Sigma 公司）；LEICA VT 1000S 振動切片機（美國Leica 公司）；MODEL-97 拉直儀（美國Sutter Instrument 公司）；Micro1401 數模轉換器、Hum bug 電噪音消除器（英國Digitimer 有限公司）；PZMTIII-BS 精密立體變倍顯微鏡（美國WPI公司）；MINIPULS-3 蠕動泵（美國GILSON 公司）；Master-9 脈沖刺激器（以色列AMPI 公司）等。

1.2、方法

（1）實驗動物及分組。

2 周齡SD 大鼠16 只，標準清潔級，眼部無疾患，雌雄不限，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司， 隨機分為正常對照組（NC 組）和單眼形覺剝奪組（MD 組），每組8 只。單眼形覺剝奪組大鼠分別行右側眼瞼縫合術，術后飼養6 周(≥8 周齡)，處死2 組大鼠，制作視皮層腦組織切片孵育于人工腦脊液中。根據灌流人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)中加入藥物的不同，將以上視皮層切片再細分為7 組：正常對照組（NC 組）、剝奪眼對側視皮層組（CC 組）和剝奪眼同側視皮層組（IC 組）均未加任何藥物，CCI 和ICI 組均加生理鹽水，CCII 和ICII 組均加5-羥色胺鹽酸鹽（10μmol/L）。以上實驗動物的飼養和使用均遵循由國家科學技術部頒布的《實驗動物管理條例》。

（2）切片腦脊液和人工腦脊液的配制。

參照文獻的方法配制切片腦脊液和ACSF， 所需試劑均購于美國Sigma 公司。

（3）大鼠視皮層腦組織切片的制備與孵育。

用10%水合氯醛（0.3-0.4ml/100g）對大鼠進行腹腔注射麻醉，再用提前通氧（95%O2+5%CO2）且預冷（0℃）的切片腦脊液快速心臟灌注，斷頭取腦，將腦組織冠狀切割成厚度400μm 的腦組織切片，視皮層的形態辨別參考文獻， 將腦組織切片置于提前通混合氧≥30min 的ACSF 中，孵育1h 待用。

（4）離體腦組織切片視皮層LTP 的誘導。

將1 張腦組織切片置于記錄槽內， 通有混合氧的ACSF（28℃-32℃）持續灌流入記錄槽，速度為3-4ml/min。參照文獻放置刺激電極和記錄電極。由Master-9 脈沖刺激器輸出刺激（波寬：50μs；頻率：0.1Hz），記錄基礎刺激之前先檢測刺激強度與神經元場突觸后電位（field postsynaptic potential，fPSP）的關系，選取的最適刺激強度約為最大反應（40-60）%所對應的刺激強度，待fPSP 穩定達10min，給予最適刺激強度的強直高頻刺激（high frequency stimulation，HFS，100Hz）誘導LTP，持續記錄1h。選取PSP 下行波振幅的10%和50%計算場突觸后電位斜率（fPSP slope），設定基礎刺激(10min)fPSP 斜率為100%，對HFS 后(51min-60min)fPSP 斜率的變化進行分析。

（5）統計學分析。

（6）應用SPSS21.0 統計學軟件進行統計分析，數據以均數±標準差（）表達，多組均數間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小差異顯著法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2、結果

2.1、HFS 誘導的正常對照組和單眼形覺剝奪組雙側視皮層LTP

HFS 后視皮層fPSP 斜率（%）變化：正常對照組為（198.1±13.5）%，剝奪眼同側視皮層組為（144.5±2.0）%， 剝奪眼對側視皮層組為（106.3±8.3）%，3 組間差異有統計學意義（F=236.858，P＜0.001），且3 個組之間差異均具有統計學意義（P＜0.05）（圖1）。

2.2、5-HT 對單眼形覺剝奪組大鼠雙側視皮層LTP 的影響

HFS 后剝奪眼對側視皮層fPSP 斜率(%)變化：生理鹽水處理組為（106.3±8.3）%，5-HT 處理組為（156.9±7.5）%，差異有統計學意義（t=-15.766，P＜0.001）；HFS 后剝奪眼同側視皮層fPSP 斜率(%)變化：生理鹽水處理組為（144.8±2.3）%，5-HT 處理組為（192.2±8.6）%，差異有統計學意義（t=-16.958，P＜0.001），且2 個5-HT 處理組之間差異有統計學意義（t=9.367，P＜0.001）（圖2)。

圖1 HFS 誘導的正常大鼠和單眼形覺剝奪成年大鼠雙側視皮層fPSP斜率(%)變化

圖2 5-HT 對HFS 誘導的單眼形覺剝奪成年大鼠雙側視皮層fPSP斜率(%)的影響

3、討論

從胚胎時期視覺神經系統的發育就已開始并且持續至出生后，這一過程由不成熟逐漸發育至成熟狀態。大鼠視覺系統發育的關鍵期為出生后第14-45 天，成年期為出生后8-48 周。以往人們認為視覺發育關鍵期結束，視皮層突觸可塑性消失，但隨著相關研究的深入，發現成年大鼠視皮層仍具有突觸可塑性。據此本實驗選擇出生后2 周齡未睜眼大鼠行右側眼瞼縫合術， 再飼養到至少8周齡，建立經典的單眼形覺剝奪性成年弱視大鼠模型。

視皮層V1M 區稱為初級視皮層區， 而視皮層神經回路有垂直連接和水平連接方式兩種方式。Li 等人研究發現，視皮層垂直連接神經纖維較水平連接神經纖維成熟的更慢， 表現出的突觸可塑性也較大。LTP 作為研究視皮層經驗依賴眼優勢可塑性的經典指標，被廣泛應用于學習記憶相關領域。既往誘導視皮層LTP 采用TBS刺激模式，由于成年大鼠視皮層突觸可塑性較幼年鼠下降，本實驗采用脈寬較小且頻率較高的HFS 誘導成年大鼠視皮層LTP。

Baroncelli 等人研究發現， 豐富環境可恢復成年弱視大鼠眼優勢可塑性， 通過高效液相色譜分析法發現居于豐富環境的弱視大鼠視皮層5-HT 含量較正常環境大鼠含量升高，并且在哺乳動物的視網膜和視皮層也存在5-HT。因此，5-HT 與成年大鼠視皮層突觸可塑性有相關性，這也和我們的實驗結果5-HT 可提高成年弱視大鼠視皮層fPSP 斜率相吻合。

綜上所述，在新生大鼠睜眼之前行視覺剝奪至成年期，初級視皮層神經元傳導神經沖動的效率降低，突觸可塑性明顯下調，應用5-HT， 可一定程度促進視皮層神經傳遞， 從而逆轉眼優勢柱的轉移，這為成人弱視的治療提供了新的參考依據。