與NF-κB相關的長非編碼RNA-NKILA 在神經系統疾病中的研究進展

胡雪純, 程 穎, 屈陽柳綜述， 賈 妮審校

長非編碼RNA(long non-coding RNAs,LncRNAs)具有重要的生物學功能，可在多個層面調控基因表達，是神經系統疾病病理過程的重要解密分子。在神經系統疾病中，NF-κB的激活與細胞凋亡和神經元活化關系密切。2015年新發現了一種LncRNA-NKILA能有效防止NF-κB通路的過度激活，因此NKILA可能是神經系統疾病病理過程中重要的機制調節分子。通過檢索近年來國內外發表的所有NKILA相關的文獻，下文將對NKILA在神經系統疾病中的研究進展進行如下綜述。

1 長非編碼RNA-LncRNAs

1.1 構成單位 在人類基因組中，約2%的基因組序列在經歷轉錄、再翻譯環節后，合成蛋白質發揮其生物學效應；而其余98%的基因，因其轉錄為RNA后不具有“編碼蛋白質”的功能，而被稱為非編碼RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)[1,2]。其中，有一類ncRNAs因其長度較長(>200 bp)，而定義為長非編碼RNA(long non-coding RNAs,LncRNAs)[3]。

1.2 作用機制 LncRNAs屬基因組學領域，其主要位于細胞核內，大多具有著poly-A尾巴和5’端加帽的mRNA樣結構，由RNA聚合酶Ⅱ轉錄后，不經過翻譯，而在直接經歷剪接、5’端加帽、3’端多聚腺苷酸化等共修飾和RNA折疊過程[4]，形成二級空間結構后才能發揮其生物學作用。LncRNAs可以在不同水平階段調節DNA、RNA及蛋白質：(1)轉錄前階段：改變DNA和組蛋白表觀，影響下游轉錄；(2)轉錄階段：影響RNA聚合酶活性，調節轉錄因子表達[5]；(3)轉錄后階段：在翻譯過程中，通過“磷酸化、泛素化等”過程，影響蛋白質活性[6]。總言之，LncRNAs可以起到信號子、誘導子、結構支架等作用[7]。

1.3 功能定位 對LncRNAs的功能認識在經歷不斷深化研究后，目前認為：種類繁多、數目龐大的LncRNAs不僅調控人體的生理過程，還幾乎參與了所有病理狀態的調控。在LncRNAs與疾病關系的研究方向中，概括其研究領域大致可分為：(1)各種癌癥的診斷及治療靶點：LncRNAs的異常表達會引發多種疾病，其中主要與腫瘤的發生密切相關[8]，目前眾多研究證實LncRNAs參與調控非小細胞肺癌[9]、肝癌[10]、乳腺癌[11]、前列腺癌[12]、甲狀腺癌[13]等的增殖、侵襲、轉移過程；(2)神經系統疾病的診斷及治療靶點：有研究表明，約有40%的LncRNAs在大腦中表達，參與人類大腦的神經發育過程[14]。LncRNAs的表達失調會導致神經系統的病理現象，目前已有LncRNAs與腦缺血[15]、顱腦損傷[16]和原發性腦瘤[17]等,但其中LncRNAs發揮的作用機制還尚未研究清楚。因此，現階段對LncRNAs在正常生理水平和病理狀態下的信號通路機制的研究成為了熱點，希望能為疾病的發生發展和治療提供新的思路和潛在靶點。

2 核因子κB-NF-κB

2.1 構成單位 核因子κB(Nuclear factor-kappaB，NF-κB)是Sen和Baltimore[18]于1986年首次在B細胞中提取出來的核蛋白因子，幾乎存在于所有的動物細胞中[19]。NF-κB蛋白家族有5個基本組成單位(又稱誘導型轉錄因子)：RelA(p65)、RelB、c-Rel、p50、p52[20]，其中，前3個亞單位可組成一組亞基，后兩個成員P50和P52組成另一組亞基，這兩組亞基通過相同或搭配組合，形成同源或異源二聚體[21]，此時經過二聚化后的NF-κB才被激活發揮生物學效應。此外，在NF-κB信號通路中，有兩個蛋白-IκB與IKK發揮著重要的調節作用。IκB(inhibitor of NF-κB)是NF-κB信號通路的抑制物，該蛋白可與處于未被激活狀態下的NF-κB結合形成非活性的胞質復合體；而IKK(IκB kinase)是IκB激酶，當經歷細胞內、外刺激后，IKK會被激活，此時IκB將發生磷酸化并出現化學結構的改變[22]。

2.2 作用機制 在正常生理狀態下，NF-κB蛋白處于靜息態在細胞質中，并與IκB-α結合，組成一個無活性的復合物[23]。而當受到各種刺激時，IκB激酶(IKK)被激活，IκB-α被磷酸化后再被泛素化降解；此時，胞質內NF-κB被解聚脫落，IκB-α發揮的“抑制NF-κB激活”的效應消失，NF-κB被激活[22]；隨之，解綁脫離下來的NF-κB轉入細胞核，與多種靶基因的啟動子或增強子區的NF-κB結合位點特異性結合[21]，調控靶基因的轉錄表達[24]。然而，NF-κB的激活并不是單方向的、持續的。當NF-κB完成其促進轉錄的任務后，會出現一個負反饋機制，即NF-κB反向激活、表達IκBα，從而二者重新靶向結合成無活性復合體[25]。由此可見，精細調控NF-κB信號通路仍具有著復雜性與未知性。

2.3 功能定位 NF-κB是細胞內最重要的轉錄因子家族，在炎癥、免疫、細胞增殖、分化和生存中發揮著關鍵作用。在神經系統中，NF-κB廣泛分布在神經元細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞中[26]。在神經系統疾病的病理學相關研究中，我們發現NF-κB對神經細胞的影響具有雙面性：(1)當NF-κB被短暫激活時，能誘導BCL-2、BCL-XL、BIRC5等神經元保護因子的轉錄[27]，這類抗細胞凋亡基因的表達，能發揮神經元保護作用；(2)但如果NF-κB被廣泛的、持續的激活表達后，也能產生iNOS、COX-2等[27]，這類促細胞凋亡基因的表達，會導致神經元死亡等病理狀態。因此，在對疾病的治療機制探索中，把握NF-κB的適度激活具有重大意義，有待進一步研究。

3 LncRNA-NKILA

3.1 NKILA的生理概況 2015年，Liu等[28]人在研究乳腺癌時首次鑒別出了一個LncRNA家族的新成員，這個新發現的LncRNA由染色體20q13基因編碼[29]，長度為2570 nt，能參與調控NF-κB信號通路，因此在對其命名中涵蓋了與NF-κB的相互作用關系：NF-KappaB Interacting LncRNA，簡稱為NKILA。在對NKILA的基礎研究中發現：在NKILA的轉錄起始點(TSS)上游的104-95位置上[30]，存在一個與NF-κB結合的特異性位點。在生理狀態下，NKILA通過兩種作用方式：(1)NKILA直接隱蔽IKK酶的磷酸化位點從而抑制IκB磷酸化作用[31]；(2)NKILA結合在NF-κB家族誘導型轉錄因子之一RelA(p65)的兩個位點上，穩定的結合在NF-κB/IκB復合物上[32]，從而使NF-κB信號通路處于靜息未被激活的狀態。簡言之，這個新發現的LncRNA-NKILA是NF-κB信號通路的負性調節因子，它能有效防止NF-κB通路的過度激活。因此，新的研究熱點開始集中于探究：在各類疾病中，NKILA的表達有什么變化；在病理狀態下，調節NKILA的表達量能否通過NF-κB信號通路的機制鏈發揮疾病治療作用。

3.2 NKILA的研究熱點 檢索自NKILA發現以來的5 y里國內外所有研究文獻，發現對NKILA的病理學研究主要集中在癌癥疾病中。如在對乳腺癌患者NKILA表達情況的研究中，發現：與健康人對照組相比，乳腺癌患者的癌細胞內NKILA的表達出現下調[33]；而通過轉染NKILA過表達載體以后，(1)NKILA的過表達會誘導癌細胞的凋亡率上升，而抑制癌細胞的增殖、遷移；(2)NKILA過表達會顯著抑制IκBα的磷酸化水平和P65的核轉位，抑制NF-κB信號通路的激活；(3)NKILA的過表達通過NF-κB信號途徑顯著抑制IL-6和VEGFA mRNA的表達。探究NKILA影響血管生成后對腫瘤的治療作用機制：在癌癥中，與腫瘤相關的血管生成將為腫瘤的生長、侵襲和轉移提供血供養分[34，35]，使預后惡化，而NF-κB、白介素6(IL-6)和血管內皮生長因子(VEGFA)的表達與血管生成密切相關[36]。因此，干預NKILA的過表達從而抑制NF-κB/IL-6/VEGFA信號，會使乳腺癌的血管生成減少，會遏制住乳腺癌的惡性進展。再比如大腸癌NKILA表達的研究[37]：在大腸癌患者的癌組織、癌細胞中均發現了NKILA表達的下調；并且NKILA病理狀態下的低表達使NF-κB的過度激活，從而與腫瘤體積大、惡性度高、出現淋巴結轉移、疾病預后差關系密切。此外，相同的病理表達情況在食管鱗狀細胞癌[38]、非小細胞肺癌[39]、鼻咽癌[40]、肝癌[30]、直腸癌[41]、舌鱗狀細胞癌[42]等研究中也得到了相同結論的印證：NKILA在癌細胞內的表達明顯降低，且NKILA的低表達與不良生存結局相關。NF-κB的異常激活是許多癌癥發生的基礎，若使NKILA過度表達，即能通過抑制NF-κB的過度激活抑制癌細胞的運動行為，降低了其向體內外的增殖、轉移、侵襲能力。因此，NLILA不僅有望作為癌癥的潛在診斷和預后標志物，也可被視為是一種抑癌LncRNA，通過阻斷NF-κB信號抑制癌癥的病情進展，成為治療的關鍵調節靶點。

3.3 NKILA的調節因子 眾所周知，LncRNA含有小分子RNA(microRNAs，miRNAs)的結合位點，miRNAs通過去烯基化途徑能夠降解LncRNA的PolyA尾巴[43]。正如研究發現：在NKILA的1203-1234 nt上，存在著miR-103和miR-107的特異性結合靶點；當NKILA與miR-103/107特異性結合后，NKILA會被迅速降解[28]；隨之，將會出現NF-κB信號通路的激活。在腫瘤細胞中，miR-103/107的水平顯著異常上調，此時NKILA會被高表達的miR-103/107大批量降解[44]，從而異常激活高表達的NF-κB會導致癌細胞的體外增殖、侵襲、轉移，疾病預后不良。反之，如果使用miR-103/107的反義寡核苷酸使NKILA不被降解，則NKILA仍能發揮對NF-κB信號通路的抑制作用，能抑制癌細胞的運動行為，降低不良預后。

4 NKILA與神經系統疾病

對比其他系統，LncRNAs優先富集分布于神經系統中，目前已知約40%的LncRNAs在大腦中表達，LncRNAs參與著大腦的復雜性調節過程[45]。LncRNAs不僅參與人類大腦的進化神經發育過程，也參與腦組織的多種生理病理過程[46]，LncRNAs是神經系統中不可忽視的調節型RNA。近年來的研究顯示：在老年人和神經系統疾病患者中，LncRNAs會出現異常表達，因此研究人員都在推測：LncRNAs是神經系統疾病病理過程的重要解密分子，LncRNAs有望成為神經系統疾病診斷和治療的新靶標[47]。其中，2015年才首次發現的LncRNA-NKILA在神經細胞中的表達和潛在功能才剛開始研究。檢索國內外相關文獻數據庫，迄今為止找到了數十篇相關的實驗室觀察及臨床研究，下文將對其進行詳細分述。

4.1 NKILA與缺血性腦卒中 目前，全世界嚴重的人口老齡化問題使卒中的發病率和死亡率不斷攀升。作為全球第2大死亡原因，卒中在我國卻是全因死亡的首要疾病[48]，其中缺血性腦卒中占69.6%～70.8%[49]，因此，開發新的治療方法以應對卒中疾病迫在眉睫。在卒中的治療環節中，本以為快速恢復腦缺血半暗帶的血液供應，會使瀕死的神經元細胞還有望存活，然而現實卻可能會面臨血液再灌注后神經元更嚴重的損傷[50]，對此病理現象的機制解釋，目前仍未完全明確，但也總結出了以下方面：誘導炎癥級聯反應不斷擴大、氧化應激、代謝毒素積累、酸中毒、細胞凋亡等[51]，對其機制的研究仍亟待廣泛深入挖掘。

Mei W[52]等人在NKILA與缺血性腦卒中關系的研究中發現：對神經細胞進行氧葡萄糖剝奪/再氧合(OGD/OGDR)的缺血再灌注模型后，NKILA表達顯著上調，NF-κB的靶基因Bfl1/A1和Bcl-XL蛋白的表達水平顯著受抑制，神經細胞的活力下降，促凋亡蛋白caspase-3激活，誘導了神經元的凋亡壞死。分析此實驗結果：NKILA的高表達使其隱蔽IKK酶磷酸化位點以及結合NF-κB/IκB復合物的能力明顯上升，通過抑制NF-κB的激活，減少NF-κB過度活化對神經細胞存活造成的進一步損害[53]。該實驗還通過調節NKILA的表達以進一步觀察腦缺血再灌注與NKILA、NF-κB的關系，發現：當shRNA介導NKILA沉默(NKILA shRNA)時，OGDR誘導的NF-κB抑制狀態幾乎被完全逆轉，NF-κB被激活，同時作用下游凋亡級聯通路的蛋白激酶caspase-3的表達下調，能抑制神經細胞的凋亡，發揮神經保護作用；反之，在轉染慢病毒載體使NKILA過度表達時，NF-κB被顯著抑制，神經細胞進一步凋亡、壞死，神經細胞活力顯著降低，再灌注損傷更嚴重[52]。這提示我們：NKILA不僅有望成為缺血性腦損傷新的診斷靶標，在缺血性腦損傷病程中，也有望通過沉默NKILA的表達來抑制神經元凋亡，發揮神經保護作用，成為應對腦缺血再灌注損傷的新治療靶點。此外，還有研究發現：腦缺血再灌注會誘導神經元細胞的miR-103/107表達下調[52]，則其降解NKILA的作用減弱，從而出現NKILA的表達增加，神經元的凋亡。因此，應用miR-103/107模擬物轉染技術上調其表達，可能會通過miR-103/107→NKILA這一調控通路環節發揮抑制神經細胞的死亡、促進神經細胞的生長發育的作用，這有待我們進一步深入研究。

4.2 NKILA與腦出血 腦出血是一類死亡率、致殘率極高的疾病。在急性期時，出血部位血腫直接壓迫腦組織，炎性因子被激活，出現顱內壓增高及相應功能區的神經功能缺損癥狀[54]；目前對急性期的治療主要以降顱壓、控制血壓、手術等對癥治療為主。繼而，腦出血后腦組織繼發的炎癥損傷、小膠質細胞的激活、炎性因子的表達，對腦組織的傷害也尤為重要，導致腦內細胞缺血缺氧性壞死凋亡。長非編碼RNA(LncRNAs)是一類與腦功能和神經系統疾病相關的分子，近年來多個研究報道了腦出血后腦組織中LncRNAs的表達有差異[54]。其中，Jia JY等人[55]在動物實驗中發現：與正常組與假手術組大鼠相比，腦出血(ICH)組大鼠NKILA表達呈低表達，而神經元蛋白中IκBα、p-IκBα、P65、p-P65表達增加，NF-κB信號通路處于激活狀態。當腹腔注射抑制NKILA表達的小干擾因子(siRNA)后，ICH+siNKILA組大鼠的NKILA表達更低，IκBα、p-IκBα、P65和p-P65的表達增加更明顯，神經功能缺損評分、血腫體積、腦水腫程度、神經元腫脹程度更差，炎性細胞浸潤程度、細胞凋亡、神經元變性壞死更嚴重。反言之：NKILA能通過抑制NF-κB的活化程度而控制腦出血的不良進展。有研究表明，NF-κB的激活在腦出血后炎癥反應中起著重要作用，是腦出血后6個月不良預后的獨立預測因子[56]。因此，干預NKILA過表達可能會通過抑制NF-κB的過度激活，控制腦出血后的炎癥級聯反應，NKILA有望成為治療腦缺血的重要調節靶點。

4.3 NKILA與癲癇 癲癇是常見的神經系統疾病之一，目前不論是癲癇動物模型實驗還是癲癇患者臨床觀察試驗，均早已證實LncRNAs參與了癲癇的發病機制[57,58]。癲癇的病理過程往往伴隨著數百個LncRNAs的表達波動。在2020年發表的一項臨床觀察中，Mirzajani[59]等人使用QRT-PCR法對80例癲癇患者(40例難治性、40例非難治性)和40例正常人的外周血進行LncRNAs表達檢測時，發現：癲癇難治組、癲癇非難治組的NKILA表達水平均高于健康對照組，但難治組和非難治組之間的表達水平沒有差異，即：癲癇患者的LncRNA-NKILA表達普遍升高。同樣的，目前在癲癇動物模型及臨床觀察實驗中均證實了核轉錄因子NF-κB參與了癲癇的發病機制。如在一項動物實驗中發現：癲癇動物模型中，海馬CA1區、CA3區、神經元細胞中均有NF-κB被激活高表達的情況，并伴隨著iNOS的高表達，最終導致海馬神經元死亡。如韋倩娜[60]等人的臨床觀察中發現：癲癇患者腦組織及外周血中炎性細胞因子(如IL-1β、TNF-α、COX-2等)顯著增高，進一步激活NF-κB信號通路。即：NF-κB活化介導的炎癥反應過程可能是癲癇發病機制中的重要環節。

綜上所述，癲癇患者NKILA的高表達可能是由于NF-κB過度激活誘導的，而高表達的NKILA能遮擋IκB的磷酸化位點，從而抑制NF-κB通路的繼續激活，起到對癲癇病理機制的調節作用。因此，在以后癲癇疾病的研究中，可對NKILA進行更加深入的調節機制探索。

5 結語與展望

綜上所述，LncRNAs作為基因組學領域的新發熱點，近些年來得到了快速的發展。其中，新發現的LncRNA-NKILA參與了眾多疾病的病理過程，尤其在腫瘤相關領域。而在神經系統疾病中，目前僅觀察到NKILA參與缺血性腦卒中、腦出血、癲癇的病理過程，且無論細胞處于靜息狀態還是炎癥激活狀態，NKILA均能有效防止NF-κB通路的過度激活，從而參與細胞的凋亡和神經元的活化。因此，未來深入探索神經系統疾病中NKILA的表達和病理作用機制具有著光明的研究前景，NKILA不僅有望成為神經系統疾病的診斷生物標記物，也會為發病機制的研究提供新的思路方向。