Notch信號通路在肺動脈高壓肺血管重構中的研究進展

李明星，顧勝龍，應苗法，金燁成，趙 蕊

(浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院藥劑科，浙江 杭州 310016)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是由多種致病因素引起的遠端肺動脈壓和肺血管阻力升高，導致肺血管重構的發生，最終引起右心功能受限的慢性進展性疾病[1]。PAH發生的病理機制復雜，涉及遺傳因素和環境因素，引起多種相關基因的突變，如骨形成蛋白受體2(bone morphogenetic protein receptor 2，BMPR2)、內皮素1、五羥色胺轉運體等[2]。目前研究發現，Notch信號通路對調控血管平滑肌細胞和血管內皮細胞的增殖、分化、凋亡具有重要作用，廣泛參與動脈粥樣硬化、肺動脈高壓、心肌梗死等心血管疾病的發生[3]。本文主要對Notch信號通路參與肺動脈高壓肺血管重構發生的過程作一綜述，以期為肺動脈高壓治療藥物的開發提供新的思路。

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1 PAH的概況

據2015年歐洲心臟病學會和歐洲呼吸學會制定的PAH診斷和治療指南，PAH被定義為：在血流靜息狀態下，平均肺動脈壓≥25 mmHg，肺動脈楔壓≤15 mmHg，肺血管阻力>3 Wood單位[4]。目前，根據病理特征和發病機制將PAH分為5大類：動脈性PAH、左心疾病引起的PAH、肺部疾病或低氧引起的PAH、慢性血栓栓塞性PAH及不明原因引起的PAH，共21個亞類。臨床常用的靶向治療藥物包括內皮素受體拮抗劑(波生坦、馬西替坦和安倍生坦)、5-磷酸酯酶抑制劑(西地那非、他達拉非)、鳥苷酸環化酶激動劑(利奧西呱)、前列環素類藥物(依前列醇、伊洛前列素、曲前列尼爾和貝前列素)及選擇性前列環素受體激動劑(司來帕格)[5]。最新調查表明，成年人PAH的年發病率約為每百萬人中有3～10例，且女性的發病率大于男性[6]。目前，由于PAH靶向治療藥物的療效和預后效果有限，以至于PAH患者的中位生存期約為2.8年，且患者易產生耐藥性；因此，深入探究PAH的發病機制及作用靶點，有利于新的治療藥物的開發。

2 Notch信號通路的作用機制

Notch信號通路主要由Notch受體、配體和細胞內效應分子(CBF1/suppressor of hairless/Lag-1, CSL)組成，相鄰細胞的受體與配體在細胞間結合，活化Notch通路，調控下游靶基因的表達，介導細胞的增殖、分化和凋亡。目前研究發現，Notch有4個同源受體：Notch-1、Notch-2、Notch-3和Notch-4，Notch-1在內皮細胞和平滑肌細胞中均有表達，Notch-2在多種細胞中廣泛表達，Notch-3表達于平滑肌細胞，Notch-4主要表達于內皮細胞。Notch配體存在于細胞表面，是一種單鏈跨膜蛋白，含有5個同源配體，即Dll-1，Dll-3，Dll-4，Jag-1 和 Jag-2；CSL為核轉錄因子，能夠識別Notch通路下游的靶基因并與其啟動子上DNA序列結合，發揮生物學效應[7-8]。

目前的研究發現，Notch信號通路的激活包括CSL依賴途徑(經典的Notch信號通路)和非CSL依賴途徑(非經典的Notch信號通路)。當Notch受體與配體結合后，Notch受體在胞外域S2位點和跨膜片段S3位點分別被ADAM金屬蛋白酶和γ-分泌酶切割，釋放Notch胞內片段(Notch intracellular domain，NICD)，NICD轉移至細胞核并與CSL結合，調控下游靶基因發狀分裂相關增強子(hairy and enhancer of split，Hes)、Hey、細胞周期調節因子p21及細胞周期蛋白等的表達，調節細胞的增殖、分化及凋亡；但在活化過程中，NICD能被細胞周期蛋白依賴性激酶8(cyclindependent kinase 8, CDK8)磷酸化，并被E3泛素連接酶靶向蛋白酶體降解，導致Notch信號活化半衰期較短[9]。在Notch信號通路活化的過程中，Notch信號組成基因的突變會引起一系列遺傳性疾病，如骨質疏松癥、T淋巴細胞白血病、腦血管疾病及精神分裂癥、腫瘤等[10]。

在PASMC中，Notch-Ca2+信號通路也參與了調控細胞的增殖、分化及凋亡的過程；在先天性PAH-PASMC中，鈣敏受體(Ca2+sensing receptor，CaSR)表達上調，細胞外Ca2+進入細胞內，促進細胞的增殖；采用Jag-1蛋白處理PASMC15～60min，能夠活化Notch信號通路，增加儲存的鈣釋放(store-operated Ca2+entry, SOCE)，細胞內Ca2+濃度增加，促進PASMC的增殖[25]。后來的研究顯示，在PASMC中，低氧和Jag-1誘導Notch3信號通路的活化，上調CaSR，增加細胞內Ca2+濃度，促進PASMC的增殖；采用DAPT處理PASMC和低氧誘導的大鼠，大鼠右心室收縮壓、右心肥厚指數、右心室心肌纖維化的程度均降低，PASMC的增殖率也明顯降低，減輕PAH肺血管重構[26]。另外，低氧能夠誘導PASMC中Notch3信號的活化，上調經典的瞬時受體電位6(canonical transient receptor potential 6，TRPC6)通道，增加SOCE并調控細胞內Ca2+濃度，促進PASMC的增殖，誘導血管重構；采用DAPT干預能夠逆轉此過程，降低肺動脈壓力，緩解低氧誘導PAH[27]。由此揭示，CaSR和TRPC通過Notch信號通路共同調控PASMC的增殖，介導PAH肺血管重構。

3 Notch信號通路在肺動脈高壓肺血管重構中的作用

進一步的研究發現，TGF-β1和MCT能夠明顯上調人微血管內皮細胞中Notch3和細胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule，ICAM1)的表達，下調Id的表達，誘導肺血管重構的發生；采用胸腺素β4處理內皮細胞，Notch3和ICAM1的mRNA表達顯著減少，減輕右心室肥厚，發揮血管保護作用[21]。內皮細胞特異性脯氨酰基羥化酶2(prolyl hydroxylase 2，PHD2)在調控肺血管重構過程中具有重要作用，敲除PHD2的小鼠肺動脈壓力和右心室體積逐漸升高，且Notch3和TGF-β的表達顯著增加，肺動脈血管纖維化，誘導PAH肺血管重構的發生[22]。由此表明，Notch信號通路參與了血管內皮細胞凋亡的調控，但其在肺動脈血管內皮細胞凋亡誘導的肺血管重構發生中的研究較少，還有待進一步研究其可能的作用機制。

第二課堂學分認定流程各個高校雖然有差異，但學分的認定統一由教務處制定規則，各個二級學院以及學生處等根據管理范圍為學生認定。各高校對學生第二課堂學分認定現狀存在以下問題：

在PAH發生過程中，肺動脈平滑肌細胞(pulmonaryarterial smooth muscle cells，PASMC)和肺動脈內皮細胞(pulmonary arterial endothelial cells，PAEC)的過度增殖及凋亡抑制，能夠引起肺動脈血管中膜增厚、內膜損傷及肺動脈收縮性增加，最終導致肺血管重構及PAH的發生[13]。有研究發現[9]，Notch信號通路參與調控血管內皮細胞和平滑肌細胞的分化和凋亡，對維持血管穩態具有重要作用，參與肺動脈血管重構的過程。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，Ang-Ⅱ)通過活化Notch信號通路誘導血管平滑肌細胞的增殖，肺動脈血管內膜增厚，導致肺血管重構的發生；采用Notch信號通路抑制劑DAPT干預，能夠抑制Notch信號通路的激活，但Notch1和Notch4受體的表達無改變，Notch信號通路下游的同型半胱氨酸反應性內質網駐留泛素樣結構域1蛋白(homocysteine-responsive endoplasmic reticulum-resident ubiquitin-like domain member 1 protein，HERP1)和HERP2表達降低，抑制中膜的增厚，抑制Ang-Ⅱ誘導的肺血管重構[14]。在低氧誘導的PAH小鼠模型中，小鼠右心室收縮壓升高、右心肥厚，伴隨著Notch3通路被激活，發生肺血管重構；給予小鼠腹腔注射Notch信號抑制劑DAPT，能夠抑制PASMC的過度增殖，降低肺動脈壓力及減輕肺血管重構[15]。另外，在野百合堿(monocrotaline，MCT)誘導的PAH大鼠模型中，Notch3和NICD3表達水平升高，肺血管細胞異常增殖、凋亡減少，導致肺動脈血管重構；Notch信號抑制劑DAPT能夠抑制肺血管細胞的增殖，促進其凋亡，改善肺血管重構[16]。因此，探討Notch信號通路在肺血管重構發生中的作用具有重要的意義。

另有研究發現[29]，Notch2在血管平滑肌細胞中廣泛表達，參與調控平滑肌細胞的增殖、遷移過程；沉默Notch2會導致肺動脈組織中平滑肌細胞增殖減少，肺動脈異常狹窄。腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor α，TNF-α) 在PAH患者肺動脈組織中高度表達，小鼠轉染過表達的TNF-α能夠引起自發性的PAH；進一步研究顯示，TNF-α能夠下調PASMC中BMP6的表達，TNF-α和BMP6通過調控酪氨酸激酶c-SRC活化Notch2- Hey1/2信號通路，抑制Notch3-Hes1信號通路，促進PASMC的增殖，誘導肺血管重構的發生；采用抗TNF-α免疫藥物依那西普能夠逆轉PAH肺血管重構的進程，修復異常的BMP-Notch信號通路[30]。

對于非CSL依賴激活途徑，目前的研究較少，仍不明確其中的調控機制。在細胞質或細胞核水平上，非CSL依賴的Notch信號傳遞過程中，NICD能夠活化下游的磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/mTOR復合物2(phosphoinositide 3-kinases/protein kinase B/mTOR complex 2，PI3K/AKT/mTORC2)、Wnt/β-連環蛋白(Wnt/β-catenin)、核因子κB激酶抑制劑α/β(inhibitor of nuclear factor κB kinaseα/β，IKKα/β)、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、低氧誘導因子-1α(hypoxia induced factor 1α, HIF-1α)等信號通路并與其相互作用，取代CSL的轉錄活化，參與調控腫瘤的發生和免疫系統的激活[11]。有研究發現，顱神經嵴細胞中Notch配體Jag1的缺失與小鼠上頜發育不全或上頜骨缺陷相關；采用Jag1處理顱神經嵴細胞能夠誘導成骨細胞的分化，增加酪氨酸激酶2(Janus kinase 2，JAK2)的磷酸化，上調Notch1靶基因Hes1、Hey1的表達，誘導Runx2和骨鈣素(osteocalcin，Ocn)的表達，采用Notch抑制劑N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸叔丁酯(N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester，DAPT)進行干預，Hes1、Hey1的表達降低，但Runx2和Ocn的表達無明顯改變；JAK2抑制劑能夠明顯降低Runx2和Ocn的表達，調控成骨細胞的分化[12]。由此可知，非經典的Notch1- JAK2信號通路也參與了細胞的分化過程。

3.2 Notch信號通路對血管平滑肌細胞表型轉換的調控作用正常情況下，肺動脈血管內的PASMC處于高分化的收縮型，維持血管的彈性和收縮血管。在多種刺激因素如低氧刺激下，PASMC由收縮表型向合成表型轉化，異常增殖、遷移進入血管內膜，引起肺動脈血管內膜和中膜增生、肥大，發生肺血管重構，肺動脈壓力持續升高，引起肺動脈高壓。研究發現，在低氧和MCT誘導PAH動物模型中，Notch1、Notch3、Jag-1和HERP2蛋白在肺動脈組織中高度表達，轉染可溶性Jag-1腺病毒至PASMC，Jag-1能夠抑制PASMC的增殖并促進其凋亡，抑制Notch-HERP2信號通路的活化，使PASMC由分化表型向去分化表型轉換[23]。Notch3信號通路在調控肺血管平滑肌細胞增殖誘導的肺血管重構中具有重要的作用；在PAH患者和大鼠肺組織中，Notch3 mRNA和NICD蛋白表達上調，γ分泌酶抑制劑DAPT能夠抑制PASMC中Notch3-Hes5信號通路的活化，促進PASMC由增殖表型向去分化表型轉化，改善肺血管重構。另外，活化Notch3信號能夠誘導下游Hes1蛋白表達上調，下調p27Kip1蛋白的表達，促進PASMC的增殖，導致肺血管重構；DAPT能夠抑制Notch3-Skp2-Hes1信號的傳遞，上調p27Kip1蛋白的表達，抑制肺血管細胞的增殖并促進其凋亡，減輕肺血管重構[16,24]。

4 小結與展望

綜上所述，Notch信號通路參與調控肺動脈內皮細胞的凋亡及肺動脈血管平滑肌細胞表型轉換的過程，導致PAH肺血管重構的發生。對于肺血管重構的發生機制，目前的研究主要集中在經典的Notch信號通路上，使用γ分泌酶抑制劑DAPT阻斷Notch信號的傳遞，能夠逆轉肺血管重構的發生，減輕PAH。另外，Notch信號能夠與Wnt/β-catenin、BMP、NF-κB及鈣離子等信號通路相互聯系，共同調控肺血管的重構，但目前揭示復雜信號通路參與調控肺血管重構的研究成果較少，其調控機制仍不清楚。因此，未來的研究應深入探索Notch信號通路參與調控肺血管重構發生的作用機制，以及其與其他信號通路的關系，篩選出調控肺動脈內皮細胞的凋亡及肺動脈血管平滑肌細胞表型轉換的靶基因，以期為Notch信號通路抑制劑及PAH治療藥物的開發提供理論依據。

3.1 Notch信號通路在血管內皮細胞凋亡過程中的作用研究發現[17]，Notch信號對調控PAEC的增殖、凋亡和遷移能力具有重要的作用。在特發性PAH患者肺動脈組織中，Notch-1的表達上調，Notch-1通過下調p21、Bcl-2和生存素的表達，促進人PAEC的增殖，抑制其凋亡；采用γ-分泌酶抑制劑AMG2008827或Notch-1 siRNA處理PAEC，PAEC的增殖和遷移能力降低； AMG2008827處理低氧誘導PAH大鼠，能夠明顯降低大鼠右心收縮壓，改善右心肥厚[18]。另有研究發現[19]，轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、Wnt、Notch信號誘導的內皮細胞-間充質細胞轉化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)參與了PAH肺血管重構的過程。在肺微血管內皮細胞中，MCT通過激活NF-κB-骨形成蛋白受體(bone morphogenetic protein receptor，BMPR)-Smad-分化抑制因子(inhibitor of differentiation，Id)-Notch3(NF-κB- BMPR-Smad-Id-Notch3)信號通路促進內皮細胞的凋亡，并發生EndMT，導致肺血管重構的發生；抑制NF-κB的活化能夠抑制下游BMPR2-Smad-Id-Notch3信號通路基因的表達，抑制MCT誘導的內皮細胞凋亡及右心肥厚，減輕肺動脈高壓[20]。另外，在MCT誘導的PAH小鼠模型中，NF-κB通路被激活，調控下游的BMPR2-Notch3信號通路，介導肺血管內皮細胞的凋亡及EndMT，導致右心室肥厚及肺血管重構的發生[20]。