谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ASCT2的研究進(jìn)展

梁寶瑜，金 春，高儷原，李余佳，王桭屹，張 峰，2，3，鄭仕中，2，3

[南京中醫(yī)藥大學(xué) 1. 江蘇省中藥藥效與安全性評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2. 江蘇省中藥功效物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、3. 中藥品質(zhì)與效能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育)，江蘇 南京 210023]

谷氨酰胺是人體內(nèi)含量最豐富的一種非必需氨基酸。而在高增殖率細(xì)胞(如炎癥細(xì)胞、干細(xì)胞、肺癌細(xì)胞)中，谷氨酰胺代謝明顯增加。谷氨酰胺進(jìn)入胞質(zhì)后，在谷氨酰胺酶的作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼幔龠M(jìn)一步在谷氨酸脫氫酶等的作用下變?yōu)棣?酮戊二酸(α-KG)，回補(bǔ)三羧酸循環(huán)，為線粒體氧化磷酸化提供碳源，保障細(xì)胞的能量供應(yīng)，因?yàn)槟芰看x穩(wěn)態(tài)是維持心肌細(xì)胞等機(jī)體細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定和功能的正常的重要保證[1]。谷氨酰胺的酰胺基和氨基還可以為多種重要生物分子(如非必需氨基酸、核苷酸、己糖胺等)的合成提供氮源，保障細(xì)胞的持續(xù)增殖。此外，谷氨酰胺是合成谷胱甘肽的重要前體，在維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用[2]。谷氨酰胺還可以作為藥物，提高小鼠大鼠心肌缺血/再灌注損傷后心肌細(xì)胞抗凋亡能力，增強(qiáng)保護(hù)性蛋白HSP70的表達(dá)[3]。因此，谷氨酰胺代謝在細(xì)胞(特別是高增殖率的細(xì)胞)的蛋白質(zhì)和能量代謝中起著核心作用。

谷氨酰胺必須通過細(xì)胞膜上特異性載體的轉(zhuǎn)運(yùn)，才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，其中命名為丙氨酸-絲氨酸-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體2(alanine-serine-cysteine transporter 2，ASCT2)的Na+依賴性谷氨酰胺載體ASCT2最為重要。人ASCT2在正常的肺、骨骼肌、大腸、腎臟、睪丸、腦中廣泛表達(dá)[4]。另外，研究表明[5]，ASCT2在結(jié)直腸癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、腎癌和腦癌中的表達(dá)明顯增加，表明谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)體ASCT2與人類生理功能及很多重大疾病有密切關(guān)聯(lián)。本文主要綜述ASCT2的細(xì)胞生物學(xué)功能及其在疾病中的調(diào)控作用的相關(guān)研究進(jìn)展。

1 ASCT2的生物學(xué)功能

2 ASCT2生物學(xué)功能的調(diào)控

2.1 ASCT2翻譯后修飾在細(xì)胞生物學(xué)中，蛋白質(zhì)翻譯后修飾作用對蛋白質(zhì)活性的調(diào)節(jié)、穩(wěn)定性，以及與其他蛋白的相互作用等細(xì)胞過程起著至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)[12]，ASCT2翻譯后修飾的一個典型路徑——N-糖基化。N-糖基化路徑能夠精確地定位蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)膜中的位置。據(jù)報(bào)道，有研究根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測的ASCT2的N-糖基化位點(diǎn)是2個天冬氨酸殘基(N163和N212)，然后用定點(diǎn)突變的方法取代這兩個殘基，驗(yàn)證了ASCT2存在N-糖基化的靶點(diǎn)。Garaeva等[6]的三維結(jié)構(gòu)顯示，N212暴露在細(xì)胞外環(huán)境中，而N163隱藏在結(jié)構(gòu)的間隙中，該三維結(jié)構(gòu)更直觀地證明了N-糖基化位點(diǎn)的存在。但是，Console等[13]在完整細(xì)胞和重組的ASCT2蛋白質(zhì)脂質(zhì)體中進(jìn)行的研究結(jié)果表明，N-糖基化/去糖基化狀態(tài)對ASCT2蛋白Na+依賴性反向轉(zhuǎn)運(yùn)中性氨基酸的內(nèi)在轉(zhuǎn)功能影響不大，但N-糖基化對ASCT2轉(zhuǎn)運(yùn)到膜上的過程至關(guān)重要。所以非糖基化重組的ASCT2適用于人ASCT2的功能研究。

在細(xì)胞不同的生命時(shí)期，同一個分子可能有不止一種的修飾作用，而且這些作用可能是短暫的，也可能是穩(wěn)定持久的。Aebersold等[14]發(fā)現(xiàn)另一個常見的ASCT2翻譯后修飾作用是絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的磷酸化。磷酸化通常與蛋白功能的特殊階段(信號激活或抑制)聯(lián)系在一起。前期文獻(xiàn)報(bào)道，在表達(dá)人類ASCT2異構(gòu)體的X卵母細(xì)胞中，放射性標(biāo)記的絲氨酸的攝取受到蛋白激酶SGK1、3和PKB活性的影響，但該研究沒有明確ASCT2序列中的磷酸化序列。Palmada等[15]假設(shè)激酶活性對ASCT2的動力學(xué)最大轉(zhuǎn)運(yùn)速度Vmax有影響，但不影響它的動力學(xué)米氏常數(shù)(半飽和常數(shù))Km。因此，他們猜測ASCT2磷酸化位點(diǎn)不在常規(guī)位點(diǎn)，或者是因?yàn)榱硪粋€未知的蛋白正在磷酸化來反過來調(diào)節(jié)ASCT2的活性。ASCT2除了N-糖基化和絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸殘基的磷酸化等翻譯后修飾外，還有賴氨酸泛素化和乙?；?，以及精氨酸單甲基化，但是對這些修飾作用的生物學(xué)意義的研究尚不夠清晰，因此本文不作闡述。

2.2 ASCT2的蛋白-蛋白間相互作用前期研究報(bào)道，ASCT2是雷帕霉素(mTOR)信號通路質(zhì)膜上的一種蛋白，它的一個重要的功能是與mTOR信號通路的聯(lián)系。mTOR是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶，通過與ASCT2以及其他幾種蛋白的相互作用，形成兩個復(fù)合物(mTORC1和mTORC2)，參與生長、能量代謝、氨基酸代謝等多種信號途徑。早前研究發(fā)現(xiàn)，人ASCT2與PDZK1(參與調(diào)節(jié)許多SLC家族成員的支架蛋白)有物理性相互作用，后續(xù)研究證明，這種物理性相互作用是通過與一類PDZ結(jié)合域結(jié)合發(fā)生的[11]。PDZ結(jié)合域是人類基因組編碼的最常見的蛋白質(zhì)相互作用域。近期研究發(fā)現(xiàn)，另一種結(jié)合蛋白質(zhì)的PDZ結(jié)合域?yàn)镾NX 27(sorting nexin 27)，它通過與ASCT2結(jié)合來提高ASCT2在質(zhì)膜中的穩(wěn)定性，從而增強(qiáng)谷氨酰胺的攝取，來保證細(xì)胞對能量和氮源的需求，另一方面，增強(qiáng)氨基酸刺激下的mTORC1激活[16]，促進(jìn)細(xì)胞的生長增殖。另有研究發(fā)現(xiàn)，銜接因子相關(guān)蛋白復(fù)合體1(adaptor-related protein complex 1 gamma 1，AP1G1)與ASCT2、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)有物理性相互作用，并形成ASCT2-AP1G1-EGFR異三聚體復(fù)合物，通過共同靶向ASCT2和EGFR，可以克服人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(human head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)對西妥昔單抗的耐藥性[17]。

2.3 氧化還原對ASCT2轉(zhuǎn)運(yùn)活性的調(diào)節(jié)作用半胱氨酸殘基在蛋白質(zhì)修飾中具有多種調(diào)節(jié)作用，還參與調(diào)控細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)。Scalise等[9]利用重組的人ASCT2蛋白脂質(zhì)體進(jìn)行的研究表明，ASCT2可以感知影響半胱氨酸殘基的氧化還原狀態(tài)的化合物，或者能夠感知直接和半胱氨酸殘基發(fā)生反應(yīng)的化合物。其中，這些還原態(tài)的化合物能刺激ASCT2的動力學(xué)最大轉(zhuǎn)運(yùn)速度(Vmax)，但不影響ASCT2對底物的親和力；而氧化態(tài)的化合物通過形成二硫鍵，會損害ASCT2蛋白質(zhì)的功能。這些研究結(jié)果表明，還原態(tài)的半胱氨酸殘基有助于ASCT2的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。后續(xù)研究采用定點(diǎn)突變技術(shù)，構(gòu)建了ASCT2在畢赤酵母(P.Pastoris)(外源蛋白真核表達(dá)體系之一)中過表達(dá)的8個半胱氨酸-丙氨酸(Cys-Ala)突變體，該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7個Cys-Ala突變體不影響ASCT2的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，但是與含巰基試劑發(fā)生反應(yīng)。只有位于核心區(qū)域的第467位半胱氨酸殘基C467的突變體不但能夠感知生理濃度下的含巰基試劑，如谷胱甘肽(glutathione，GSH)，并且是ASCT2與底物的結(jié)合以及易位的關(guān)鍵區(qū)域。這些結(jié)果表明，半胱氨酸殘基可能在生理?xiàng)l件下導(dǎo)致活化的還原性蛋白與非活化的氧化蛋白之間的相互轉(zhuǎn)換，從而使得ASCT2活化或者失活，因此，半胱氨酸殘基C467對ASCT2轉(zhuǎn)運(yùn)活性至關(guān)重要。

3 ASCT2在疾病中的作用

3.1 ASCT2在腫瘤組織中的調(diào)節(jié)目前，對ASCT2的研究主要是在能夠獲取可重復(fù)信息的癌細(xì)胞或永生化細(xì)胞系的模型中進(jìn)行的。由于腫瘤細(xì)胞的代謝重排，在這些模型中研究的分子機(jī)制與正常組織中的分子機(jī)制有很大的不同。所以，ASCT2在疾病中的調(diào)控知識是復(fù)雜的?，F(xiàn)階段的研究表明，ASCT2具有向細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，參與代謝和信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的氨基酸的功能。該功能可能與腫瘤相關(guān)蛋白有關(guān)聯(lián)。例如，Reynolds等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，通過E2F-3(transcription factor 3，E2F-3)誘導(dǎo)的ASCT2的過度表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤抑制因子成視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，pRb，RB或RB1)的下調(diào)。由于細(xì)胞周期進(jìn)程需要合成多種新物質(zhì)，而谷氨酰胺為多種重要生物分子(如核苷酸、非必需氨基酸等)的合成提供氮源，在蛋白質(zhì)和能量代謝中起著核心的作用，因此，Rb也可能直接調(diào)控參與谷氨酰胺代謝的蛋白質(zhì)ASCT2。另一方面，谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ASCT2和谷氨酰胺代謝在多種腫瘤細(xì)胞生存和增殖中起著關(guān)鍵的作用。MicroRNA的調(diào)控研究揭示，miRNA-137與ASCT2在多種腫瘤中具有負(fù)相關(guān)的關(guān)系。在甲基-CpG結(jié)合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2，MeCP2)和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)作用下，miRNA-137啟動子區(qū)域發(fā)生去甲基化反應(yīng)，從而增強(qiáng)其對下游ASCT2的抑制作用，進(jìn)一步抑制ASCT2表達(dá)以及谷氨酰胺代謝，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡[19]。因此，ASCT2在腫瘤組織中的調(diào)節(jié)作用與其谷氨酰胺的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，以及谷氨酰胺的代謝密切相關(guān)，可通過直接調(diào)控ASCT2的表達(dá)，或者通過ASCT2的上下游因子調(diào)控ASCT2的表達(dá)來調(diào)控谷氨酰胺代謝，抑制腫瘤細(xì)胞生存和增殖。

3.2 ASCT2在非腫瘤組織的調(diào)控ASCT2在腫瘤細(xì)胞中的調(diào)節(jié)作用已有較多研究，然而，其在非腫瘤組織中的調(diào)控作用的研究較少。Yi等[20]研究表明，谷氨酰胺由ASCT2轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入豬腸細(xì)胞，然后通過激活mTOR信號通路而不依賴AMPK信號通路，促進(jìn)豬腸細(xì)胞的生長。Liu等[21]在小鼠乳腺中的研究揭示，ASCT2的表達(dá)與依賴mTOR的氨基酸傳感器G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)有關(guān)，ASCT2可能通過GPCRs來調(diào)節(jié)乳蛋白的合成。因此，Liu等認(rèn)為ASCT2可以作為調(diào)節(jié)乳蛋白合成的分子靶點(diǎn)。ASCT2在非腫瘤組織中的調(diào)控主要通過其轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酰胺的功能來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，以及參與乳蛋白合成的調(diào)控。

4 ASCT2抑制劑的研究

谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)體ASCT2參與乳腺癌、肝癌等多種疾病的調(diào)控，因此，ASCT2可能是藥物的重要靶點(diǎn)，研究ASCT2的抑制劑可能是疾病治療的一個重要策略。較早的研究發(fā)現(xiàn)，以ASCT2首選底物谷氨酰胺衍生物的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)芐基絲氨酸(benzylserine)和芐基半胱氨酸(benzylcysteine)對大鼠ASCT2的具有競爭性抑制作用，表明可用底物模擬藥物來研究ASCT2的抑制劑。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)鏈空間位阻小、疏水性低的氨基酸衍生物與ASCT2結(jié)合位點(diǎn)具有很強(qiáng)的相互作用[22]，它以更高的親和力與ASCT2結(jié)合，從而競爭性地抑制或者阻斷谷氨酰胺與ASCT2結(jié)合。而近年利用大鼠ASCT2重組的蛋白脂質(zhì)體進(jìn)行的研究，發(fā)現(xiàn)ASCT2能通過與鼠序列中存在一種金屬結(jié)合模體(CXXC)與Hg及其有機(jī)衍生物等金屬發(fā)生反應(yīng)，從而抑制ASCT2對谷氨酰胺的轉(zhuǎn)運(yùn)[23-24]。然而據(jù)報(bào)道，人ASCT2失去了CXXC序列，但是ASCT2的半胱氨酸殘基依然能夠與Hg衍生物形成共價(jià)鍵，可以不可逆轉(zhuǎn)地阻斷ASCT2的活性[4,6,22]。ASCT2共價(jià)抑制的發(fā)現(xiàn)能夠避免在某些條件下，內(nèi)源性氨基酸(特別是谷氨酰胺)的增加，會將ASCT2抑制劑從結(jié)合位點(diǎn)上轉(zhuǎn)移的問題。近年來，在研究ASCT2的抑制劑的過程中，發(fā)現(xiàn)芐基脯氨酸衍生物能夠影響ASCT2的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，基于芐基脯氨酸衍生物支架基礎(chǔ)研究的ASCT2靶向性競爭性抑制劑應(yīng)運(yùn)而生[25]。

5 結(jié)論

ASCT2是細(xì)胞攝取谷氨酰胺的最重要的轉(zhuǎn)運(yùn)體，對維持細(xì)胞谷氨酰胺穩(wěn)態(tài)，以及依賴谷氨酰胺代謝的細(xì)胞的存活和增殖至關(guān)重要。然而，氨基酸在細(xì)胞中的穩(wěn)態(tài)是一個錯綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，化學(xué)上或基因上單純阻斷一個靶點(diǎn)的想法并不是適用于所有病理情況。同時(shí)，ASCT2在正常組織中也有廣泛表達(dá)和重要作用，直接靶向這種轉(zhuǎn)運(yùn)可能會影響到正常組織的生理活動。所以深入研究ASCT2的功能及其調(diào)節(jié)，對揭示這種蛋白在生理和病理?xiàng)l件下的作用尤其重要，而最近研究得到的ASCT2冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，將為理解ASCT2的結(jié)構(gòu)功能及其抑制劑的研究提供更精確的靶點(diǎn)，對設(shè)計(jì)出高效的，對正常組織生理活動影響小的靶向性的ASCT2抑制劑具有指導(dǎo)意義。