魚藤素對非小細胞肺癌細胞體內外增殖的影響

呂滿霞，方瓊彤，陳彥潔，柳傳毅，吳新榮

(1. 華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510641； 2. 中國人民解放軍南部戰區總醫院藥學部，廣東 廣州 510010)

非小細胞肺癌(NSCLC)是最常見的肺癌類型，約占85%[1]。盡管化療可緩解癥狀并提高生存率，但NSCLC患者的5年生存率仍然較低[2]。因此急需尋找NSCLC治療新靶點及副作用較少，可提供更有效的治療效果的新型抗癌藥物。魚藤素(Deguelin)是一種天然異黃酮類化合物，已被證明具有針對多種癌癥的抗腫瘤活性，包括肺癌[3]。因此，本實驗以A549細胞為研究對象研究魚藤素對其體內外增殖的影響，以期為魚藤素治療肺癌及其抗腫瘤活性提供新的科學依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株人非小細胞肺癌細胞株A549由中國科學院上海生命科學院細胞庫提供。

1.2 實驗動物SPF 級 BALB/c 裸鼠(♀)，3～5周齡，體質量(15～20)g，購自廣東省醫學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號編號:SCXK(粵)2018-0002，于中國人民解放軍南部戰區總醫院動物實驗中心SPF級環境下飼養。

1.3 試劑魚藤素(deguelin，批號D0817)、二甲基亞砜(DMSO，批號D2650)均購于Sigma公司；胎牛血清、RPMI 1640培養基均購于Gibco公司；胰酶消化液、PBS緩沖液購于Hyclone公司；CCK-8試劑盒(批號CK04)、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(批號AD10)、細胞周期檢測試劑盒(批號C543)均為日本同仁化學研究所產品；Hoechst 33258染色液(批號C1018)、蘇木精伊紅(HE)染色試劑盒(批號C0105)購于碧云天生物技術研究所。

1.4 實驗儀器倒置熒光顯微鏡(IX7，日本Olympus公司)；全波長酶標儀(Multiscan-GO，美國Thermo公司)；低溫高速離心機(RRESCO 17，美國Thermo公司)；流式細胞儀(BD FACSCalibur，美國BD公司)；生物組織包埋機(BM-VⅡ)；灌胃針(ZC-12，北京哲成科技有限公司)；石蠟切片機(CUT4060，德國MICROM)；自動脫水機(HP300，深圳達科為醫療設備有限公司)。

2 方法

2.1 藥物配制將魚藤素溶于少量DMSO，配制成100 mmol·L-1母液，分裝后置于-20 ℃冰箱避光保存。使用時，用培養基將母液稀釋至所需濃度，現配現用。

2.2 細胞培養從細胞庫中取出A549細胞，快速融解后于超凈工作臺中將細胞轉移至離心管中，以轉速1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入2～3 mL完全培養基將細胞吹打均勻，轉入培養瓶中，培養于37 ℃、5% CO2的恒溫箱中，待細胞密度生長至培養瓶(70～80)%時，進行傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

2.3 CCK-8法將細胞以2×107·L-1接種于96孔板中，每孔100 μL，每組設5個復孔。24 h后，取出細胞已經貼壁的96孔板，棄去舊培養基，加入不同濃度魚藤素(1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1)分別作用24、48、72 h，對照組僅含細胞及培養基，空白組僅含有培養基。然后每孔加入100 μL 10% CCK-8工作液，完畢后于孵化箱中孵育4 h，于波長為450 nm處的酶標儀測定吸光度(OD)值。計算細胞存活率/% =[(OD實驗組-OD空白組)/( OD對照組-OD空白組)]×100%，實驗平行重復3次。

2.4 赫斯特染色實驗將細胞以1×108·L-1接種于6孔板中，每孔2 mL，均勻分布。24 h后加入不同濃度的魚藤素(5、10、20 μmol·L-1)，作用24 h后將舊培養基吸出，PBS緩沖液洗滌2次，每孔加入1 mL配制好的染色液，靜置7～8 min，染色完畢，吸出染色液，隨后用PBS緩沖液洗滌2次，加入1 mL新的PBS，置于熒光倒置顯微鏡下藍色激發光下拍照。

2.5 Annexin V-FITC/PI雙染實驗細胞分組給藥同“2.4”，藥物作用24 h后收集細胞，用冷PBS緩沖液重懸細胞，離心，棄上清液，重懸于500 μL的結合液，再加入5 μL Annexin V-FITC溶液和5 μL PI溶液，吹打混勻，避光孵育15 min，隨后轉移至流式管中，流式細胞儀測定細胞凋亡率。

2.6 流式細胞術檢測細胞周期細胞分組給藥同“2.4”，藥物作用24 h后收集細胞，用冷PBS緩沖液重懸細胞，離心，棄上清液，滴加1 mL預冷的70%乙醇，置于-4 ℃固定24 h，離心，棄上清液，用冷PBS緩沖液重懸細胞，離心，棄上清液，加入500 μL按試劑盒配置好的工作液，緩慢重懸細胞，于37 ℃孵化箱中避光孵育30 min 后，轉移至流式管中，立即采用流式細胞儀進行檢測。

2.7 裸鼠移植瘤模型裸鼠適應環境1周后，碘伏消毒裸鼠右側腋下皮膚，注射200 μL制備好的A549細胞懸液，含有1×107個細胞，接種完后每天觀察腫瘤生長情況，裸鼠的活動狀況。每2 d用游標卡尺測量計算皮下腫瘤體積(V= 0.5×長徑×(短徑)2)，待腫瘤體積達到50 mm3后，將荷瘤裸鼠隨機分為4組：對照組(玉米油)、魚藤素低劑量組(2.5 mg·kg-1)、魚藤素中劑量組(5 mg·kg-1)、魚藤素高劑量組(10 mg·kg-1)，每組6只，并采用灌胃方式進行給藥，劑量為100 kg·L-1，每兩天給藥1次，每次給藥前測定裸鼠移植瘤體積和裸鼠體重，連續給藥21 d,頸椎脫臼處死。將剝離的腫瘤組織按組別及時放進10%的甲醛中固定，用于HE染色切片，于熒光倒置顯微鏡下觀察移植瘤的病理形態學變化情況。

3 結果

3.1 魚藤素對A549細胞增殖的抑制作用如Fig 1所示。與對照組相比，魚藤素作用24 h后，隨著給藥濃度的增加，魚藤素對A549細胞的增殖抑制作用明顯增加，其中魚藤素作用A549細胞24、48、72 h的半數抑制濃度(IC50)，分別為(10.82±1.21)μmol·L-1、(7.11±0.82)μmol·L-1、(5.55±0.42)μmol·L-1。同時，隨著魚藤素處理時間的延長，A549細胞的細胞存活率降低(P<0.01)。由此可見，與對照組相比，魚藤素對A549細胞增殖具有抑制作用(P<0.01)，且呈濃度和時間依賴性。

Fig 1 Effects of different concentrations of deguelin on A549 cell viability n=3)

3.2 魚藤素對A549細胞形態的影響5、10、20 μmol·L-1魚藤素作用A549細胞24 h后，赫斯特染色觀察其對細胞形態的影響。如Fig 2所示，對照組細胞密集，細胞核呈淡藍色，少量亮藍色熒光出現，表明少數細胞核受損，凋亡細胞數少；隨著魚藤素給藥濃度的增加，亮藍色熒光明顯增強且數目增多，到達魚藤素20 μmol·L-1高濃度時，細胞數量減少，細胞核均發出亮藍色熒光，細胞形態皺縮，說明魚藤素的作用下能夠損傷A549細胞形態。

Fig 2 Morphological effect of deguelin on A549 cells

3.3 魚藤素對A549細胞凋亡的影響5、10、20 μmol·L-1魚藤素作用于A549細胞24 h后，Annexin-V FITC/PI 雙染結果如Fig 3所示，其具體的凋亡細胞百分比分布見Tab 1。與對照組相比，隨著魚藤素給藥濃度的增加，細胞早期凋亡和晚期凋亡以及總凋亡的百分率升高，差異有統計學意義(P<0.01)。說明魚藤素能夠誘導A549細胞的凋亡，并呈劑量依賴性。

Fig 3 Effect of deguelin on cell apoptosis of A549 cells

Tab 1 Apoptotic cell distribution after A549 treatment with deguelin for 24 h n=3)

3.4 魚藤素對A549細胞周期的影響如Fig 4所示，對照組處于 G2/M 期的細胞百分比為(14.79±0.86)%，而5、10、20 μmol·L-1的魚藤素處理組中處于G2/M 期的細胞百分比分別為(24.91±1.35)%、(44.38±2.21)%、(45.69±1.04)%。因此，同對照組相比，魚藤素處理組中細胞處于G2/M 期的百分比增加(P<0.01)，且呈濃度依賴性，即魚藤素使A549細胞周期阻滯于G2/M期。

Tab 2 Percentage of cell distribution after 24 h treatment with different concentrations of deguelin in A549 cells n=3)

Fig 4 Effect of deguelin on cell cycle of A549 cells by flow cytometry

3.5 魚藤素對體內裸鼠移植瘤的影響魚藤素可以抑制A549異種移植模型中的腫瘤生長(Fig 5A)，給藥21 d后，對照組的腫瘤體積已達到約920 mm3，但在2.5、5、10 mg·kg-1魚藤素給藥組中，平均腫瘤體積分別約為369、251、190 mm3(Fig 5B)。同時，與對照組相比，經過魚藤素處理的組之間荷瘤小鼠的體質量沒有變化，表明魚藤素沒有明顯的毒性作用(Fig 5C)。由Fig 5D可知，在空白對照組中，可見細胞密集成片排列，細胞體積較大且不規則、細胞核顏色較深，并且有核分裂。而魚藤素處理組中可以觀察到細胞體積皺縮，排列稀疏，細胞核出現固縮，且隨著給藥量的增加，變化越明顯。由此從腫瘤細胞形態上驗證了魚藤素可抑制移植瘤的增長。

Fig 5 Tumor growth in vivo suppressed by deguelin (n=6)

4 討論

魚藤素是一種天然產物，存在于多種植物物種中，如魚藤(Derristrifoliata)，栓皮豆(Munduleasericea)，毒灰葉(Tephrosiatoxicaria)，浮氏灰葉(Tephrosiavogelii)和畢澄茄(Pipecubeba)。近年來研究發現，魚藤素或通過誘導細胞凋亡，阻滯細胞周期和抗血管生成等方面達到抑制腫瘤增殖的作用[4-6]。本研究以A549細胞為模型，發現魚藤素能明顯提高A549細胞凋亡率，抑制細胞增殖，這與Hsu等[7]研究魚藤素對肺癌細胞H460的作用結果相似，表明魚藤素能促進細胞凋亡作用。此外，研究表明魚藤素可以通過下調H1299細胞中CDK4、CDK6、CCND1基因表達使細胞阻滯在 G0/G1期，達到抗腫瘤作用[8]，而CDC2與cyclin B復合體正調控G2/M期檢查點，促進細胞進入有絲分裂，是推動細胞有絲分裂的關鍵調節因子[9]，因此進一步探討魚藤素是否通過調節CDC2與cyclin B復合體相關機制使A549細胞阻滯在G2/M 期，相關研究正在進行中。

人體腫瘤裸鼠移植瘤模型可用于研究人類疾病發生機制和生理學特性。Rygaard[10]于1969年首次建立了人結腸癌裸鼠移植瘤模型。目前，裸鼠移植瘤模型已被廣泛應用于抗腫瘤藥物的篩選中，包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胃癌和結腸癌等[11-13]。近年來，也有通過建立裸鼠移植瘤模型來研究魚藤素的體內活性的相關報道。Li等[14]于6周齡無胸腺裸鼠右側皮下接種肺癌細胞(NCI‐H1299)建立模型，腫瘤體積達到100 mm3后，魚藤素(3 mg·kg-1)給藥21 d處死裸鼠。結果表明魚藤素可通過部分抑制Bmi1和誘導Noxa表達而對移植瘤的生長具有抑制作用。Li等[15]將HepG2細胞(3×106)接種于6周齡♀無胸腺裸鼠右側皮下，當腫瘤體積接近100 mm3時，隨機分組給藥，魚藤素(4 mg·kg-1)每3 d腹腔注射給藥1次，接種細胞34 d后采用安樂死并提取腫瘤塊，通過平均腫瘤體積和質量對魚藤素藥效進行評價，結果表明同空白對照組相比，魚藤素明顯抑制體內腫瘤生長。本研究通過接種A549細胞建立裸鼠移植瘤模型來評估魚藤素對非小細胞肺癌細胞的體內抗腫瘤活性，結果表明：魚藤素可以明顯抑制A549細胞裸鼠移植瘤的生長，而對裸鼠沒有明顯的毒副作用。

綜上所述，體內外實驗表明，魚藤素對A549細胞存在抗腫瘤活性，并與誘導細胞凋亡及細胞阻滯相關，為加速開發魚藤素作為臨床抗癌制劑提供理論基礎。

(致謝：本實驗在中國人民解放軍南部戰區總醫院醫學實驗科和動物實驗中心完成，特別感謝實驗室老師的指導與幫助。)