氧化應(yīng)激在魚藤素致SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性中的作用

方瓊彤，呂滿霞，陳彥潔，柳傳毅，吳新榮

(1. 南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515；2. 中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510010)

魚藤素是一種天然黃酮類化合物，在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、凋亡和血管生成的綜合信號(hào)通路中，在腫瘤細(xì)胞凋亡和惡性轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。魚藤素對(duì)肺癌、乳腺癌、肝癌、淋巴癌及骨髓瘤等多種腫瘤具有化學(xué)防治作用[1-4]，揭示了魚藤素對(duì)多種腫瘤有潛在的預(yù)防和治療作用。但是有研究表明在高劑量的魚藤素濃度下可能會(huì)產(chǎn)生毒副作用，能夠減弱陽性神經(jīng)元酪氨酸羥化酶的活性，從而引發(fā)帕金森樣綜合癥[5]，這阻礙魚藤素成為潛在的抗腫瘤藥物。

氧化應(yīng)激對(duì)正常細(xì)胞的生長起調(diào)控作用，在腫瘤細(xì)胞代謝中也能產(chǎn)生重大的影響[6]。氧化應(yīng)激是由自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，并被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的重要因素[7-8]。由于活性氧的反應(yīng)性，高濃度的活性氧(reactive oxygen species，ROS)可導(dǎo)致細(xì)胞死亡或氧化應(yīng)激，即破壞促氧化和抗氧化水平之間的平衡，并且ROS能夠氧化各種細(xì)胞成分，導(dǎo)致細(xì)胞氧化破壞[9]。神經(jīng)元細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸含量高，耗氧量高，抗氧化防御能力弱，因此，氧化應(yīng)激極易對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷，造成神經(jīng)細(xì)胞受損和神經(jīng)元的丟失，從而演變?yōu)樯窠?jīng)退變性疾病[10-11]。

MAPK/ERK信號(hào)通路調(diào)控多種細(xì)胞活動(dòng)，包括增殖、分化、存活和死亡。MAPK/ERK信號(hào)通路的失調(diào)與許多人類疾病的發(fā)展密切相關(guān)，其中包括阿爾采末病(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森病(Parkinson's disease，PD)和各種腫瘤[12]。有相關(guān)研究表明MAPK/ERK信號(hào)通路對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)起到十分重要的作用[13]。

本研究通過測定氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)和MAPK/ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，探究魚藤素致神經(jīng)毒性的潛在相關(guān)機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株人神經(jīng)瘤細(xì)胞株SH-SY5Y,由人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科提供

1.2 試劑魚藤素(美國sigma公司，批號(hào)：D0817，HPLC 級(jí))、二甲基亞砜(美國sigma公司，批號(hào)：RNBD6895)；活性氧ROS檢測試劑盒(批號(hào)：S0033)，LDH乳酸脫氫酶測試試劑盒(批號(hào)：A020-1)，總SOD活性檢測試劑盒(批號(hào)：S0101)，脂質(zhì)氧化(MDA)檢測試劑盒(批號(hào)：S0131)，谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒(批號(hào)：S0056)，Western blot及IP細(xì)胞裂解液(批號(hào)：P0013)，100 mmol·L-1PMSF(批號(hào)：ST506)，BCA 蛋白定量試劑盒(批號(hào)：P0012)，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)(弗德生物公司，批號(hào)：FD002)，SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(批號(hào)：P0012AC)，均購自碧云天公司；蛋白Maker(美國Thermo公司，批號(hào)：26616)，山羊抗兔IgG H&L (HRP) (天津三箭，批號(hào)：LK2001)；p-ERK1/2 Rabbit mAb(批號(hào)：4370)，ERK1/2 Rabbit mAb(批號(hào)：4695)均購自Cell signaling technology；Anti-MEK1 + MEK2抗體(批號(hào)：ab178876)，Anti-MEK1 + MEK2 (phospho S218 + S222)(批號(hào)：ab194754)，Anti-CREB抗體(批號(hào)：ab32515)，均購自abcam；EGF Antibody(批號(hào)：DF2225)，GAPDH Antibody(批號(hào)：AF7021)，均購自affinity。

1.3 儀器3111 水套式CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，G41054-F000型臺(tái)式離心機(jī)(KUBOTA公司)，IX7型倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，HWS28型恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，Multiscan-GO型全波長酶標(biāo)儀，RRESCO 17型低溫高速離心機(jī)(美國Thermo公司)，BD LSRFortessa流式細(xì)胞儀 (美國 BD 公司)，ACY-1002-U型超純水機(jī)(美國 Aquapro 公司)，PowerPac 電泳儀、Sub-Cell 電泳槽、Tans-Blot Turbo Transfer System轉(zhuǎn)膜儀(美國伯樂 Bio-Rad)，MiniChemi Ⅲ化學(xué)發(fā)光成像儀(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)。

2 方法

2.1 魚藤素的配制100 mmol·L-1魚藤素母液配制：將50 mg魚藤素完全溶解于1.27 mL的DMSO溶液中，并于-20 ℃低溫避光保存，實(shí)驗(yàn)組中不同濃度的魚藤素用新鮮培養(yǎng)基稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)從液氮罐中取出神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞，迅速37 ℃水浴復(fù)蘇，并在超凈工作臺(tái)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，加入適量含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，以1 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min ，去掉上層舊液后加入新鮮培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖毒性取對(duì)數(shù)生長細(xì)胞，以5×107·L-1的密度接種于96孔板中，每孔接種細(xì)胞液100 μL，每組5個(gè)復(fù)孔，放入37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁生長。次日去除舊培養(yǎng)基，以濃度為1.56 μmol·L-1，3.13 μmol·L-1，6.25 μmol·L-1，12.5 μmol·L-1，25 μmol·L-1，50 μmol·L-1，100 μmol·L-1的魚藤素作用于SH-SY5Y細(xì)胞 24 h、48 h、72 h 后，將培養(yǎng)基與CCK-8試劑按9 ∶1比例配制的混合液以每孔100 μL加入，在培養(yǎng)箱中孵育2 h，在450 nm波長處，酶標(biāo)儀測定吸光度OD值。細(xì)胞存活率/%=[(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)] ×100%。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，后續(xù)計(jì)算得到其細(xì)胞存活率。

2.4 細(xì)胞比色法測定LDH、MDA、SOD、GPx活力根據(jù)細(xì)胞中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)催化乳酸生成丙酮酸二硝基苯肼化合物，產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng)生成的化合物在堿性溶液中呈棕紅色，通過比色法可測得細(xì)胞上清液中LDH的含量。根據(jù)細(xì)胞中的LDH漏出量，可判斷細(xì)胞的受損程度。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以1×108·L-1的密度，按每孔2 mL進(jìn)行接種，均勻分布。在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁。根據(jù)CCK-8法測定的結(jié)果設(shè)置低、中、高濃度實(shí)驗(yàn)組如下：A組：對(duì)照組；B組：12.5 μmol·L-1魚藤素；C組：25 μmol·L-1魚藤素；D組：50 μmol·L-1魚藤素。藥物處理細(xì)胞后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照LDH試劑盒操作說明進(jìn)行檢測和計(jì)算。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)法檢測細(xì)胞ROS水平取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以1×108·L-1的密度，按每孔2 mL進(jìn)行接種，均勻分布。在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁。實(shí)驗(yàn)分組同“2.4”，藥物作用24 h后收集細(xì)胞，1 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心5 min，去除上清液。用無血清的培養(yǎng)基按1 000 ∶1的比例將10 mmol·L-1的DCFH-DA母液，每個(gè)樣品用1 mL稀釋液懸浮細(xì)胞，在37 ℃避光敷育30 min。期間每隔5 min振蕩1次，離心后，PBS洗滌并重懸細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞ROS水平。

2.6 Western blot 檢測細(xì)胞中EGF、ERK、CREB蛋白的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞，每孔均勻接種2 mL密度為1×108·L-1的細(xì)胞，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h貼壁后，實(shí)驗(yàn)分組同“2.4”，藥物處理24 h后，除去舊培養(yǎng)基，加入2 mL PBS緩沖液洗滌2次，加入100 μL配置好的細(xì)胞裂解液(每1 mL的細(xì)胞裂解液中含10 μL PMSF，現(xiàn)配現(xiàn)用)，在冰上裂解30 min，期間間隔5 min吹打細(xì)胞，細(xì)胞刮收集蛋白裂解液，并置于提前預(yù)冷至4 ℃的離心機(jī)中，12 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心20 min。離心完畢，將上清液吸出，通過BCA法測定蛋白濃度，按體積4 ∶1加入5×loading buffer，于沸水中煮沸5 min，使蛋白充分變性，保存于-20 ℃冰箱中。采用12% SDS-PAGE膠跑電泳，用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂奶粉配置的TBST封閉液室溫封閉1 h，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，然后加稀釋1 000倍的一抗4 ℃孵育過夜，一抗孵育完畢，回收孵育盒中的一抗，加入1×TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。加入相應(yīng)稀釋5 000倍的二抗孵育1 h，用1×TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，最后ECL顯像液顯影，得出蛋白條帶灰度后，使用Image Jx軟件分析蛋白條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，以目的條帶光密度值和GAPDH光密度值的比值即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 魚藤素對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響濃度為1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1的魚藤素作用SH-SY5Y細(xì)胞 24 h、48 h、72 h 后，測得其細(xì)胞存活率如下圖如Fig 1 所示。隨著藥物作用濃度的增加和作用時(shí)間的延長，SH-SY5Y細(xì)胞的存活率均下降(P<0.05)。魚藤素作用于SH-SY5Y細(xì)胞24 h、48 h、72 h的IC50值分別為28.25±1.67、19.36±1.44、11.50±0.89 μmol·L-1。結(jié)果表明，魚藤素對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的增殖有抑制作用并呈濃度和時(shí)間依賴性。

Fig 1 Effects of different concentrations of deguelin on inhibitory rate of SH-SY5Y cells treated for 24, 48 and 72 h n=3)

3.2 魚藤素對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的LDH漏出量的影響細(xì)胞上清液中LDH水平反映了細(xì)胞的受損程度。0、12.5、25、50 μmol·L-1魚藤素作用于SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，測得SH-SY5Y細(xì)胞的LDH漏出量，結(jié)果如Fig 2所示。結(jié)果表明，高于25 μmol·L-1的魚藤素作用SH-SY5Y細(xì)胞后，LDH漏出量明顯增加，并呈現(xiàn)濃度依賴性。

Fig 2 The LDH leakage (% of control) of SH-SY5Y cells treated with different concentrations of deguelin for 24 h n=3)

3.3 魚藤素影響SH-SY5Y細(xì)胞的ROS水平0、12.5、25、50 μmol·L-1魚藤素作用于SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，測得SH-SY5Y細(xì)胞的ROS水平，結(jié)果如Fig 3和Tab 1所示。與對(duì)照組相比，12.5、25、50μmol·L-1魚藤素處理后的細(xì)胞內(nèi)的ROS水平明顯增加，對(duì)照組中的ROS水平為1102.4±105.6，而隨著魚藤素給藥濃度的增加，ROS水平增加，12.5 μmol·L-1、25 μmol·L-1、50 μmol·L-1魚藤素作用后測得ROS分別為1891.6±92.71、2828.3±76.49、4605.0±141.6，結(jié)果表示ROS水平的變化呈濃度依賴性，同時(shí)說明魚藤素對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞造成的損傷可能與ROS產(chǎn)生有關(guān)。

Fig 3 Determination of ROS of SH-SY5Y cells after deguelin treatment for 24 h n=3)

Tab 1 ROS intensity of SH-SY5Y cells after deguelin treatment for 24 h

3.4 魚藤素對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的SOD和Gpx活力和MDA含量的影響0、12.5、25、50 μmol·L-1魚藤素作用于SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，測定細(xì)胞中SOD和Gpx的活力以及MDA含量，結(jié)果如Fig 4 所示，與對(duì)照組相比，隨著魚藤素作用濃度的增加，SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)SOD和GPx活力出現(xiàn)逐步降低的趨勢；MDA含量明顯升高。魚藤素對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷伴隨著氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化，說明氧化應(yīng)激與其神經(jīng)毒性密切相關(guān)。

3.5 魚藤素對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞中MAPK/ERK信號(hào)通路的影響0、12.5、25、50 μmol·L-1濃度的魚藤素作用于SH-SY5Y細(xì)胞24 h后測定細(xì)胞內(nèi)MEK、EGF、RAS、CREB蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如Fig 5 所示。與對(duì)照組相比，各個(gè)濃度的魚藤素組能夠下調(diào)P-MEK、MEK和CREB蛋白蛋白的表達(dá)(P<0.05)。25.0 μmol·L-1及其以上濃度的魚藤素能夠下調(diào)EGF和RAS蛋白的表達(dá)(P<0.01)。

Fig 4 SOD(A) , Gpx(B) and MDA(C) activities of SH-SY5Y cells treated with different concentrations of

Fig 5 Expression levels of p-MEK, MEK(A) and EGF, RAS, CREB(B) in SH-SY5Y cells treated with different concentrations of deguelin for 24 h n=3)

4 討論

許多研究表明，魚藤素具有潛在的抗腫瘤活性，但是給予大鼠治療劑量的魚藤素后，大鼠出現(xiàn)了帕金森樣綜合癥[5]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是衰老和各種神經(jīng)障礙的關(guān)鍵因子，酶催化的各種氧化還原反應(yīng)在氧化磷酸化過程中發(fā)生[10]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，其體內(nèi)脂質(zhì)氧化水平會(huì)提高，同時(shí)清除自由基能力會(huì)下降，促進(jìn)了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[14]。SOD和Gpx能夠清除活細(xì)胞內(nèi)過氧化物，ROS、MDA是與脂質(zhì)氧化水平密切相關(guān)的標(biāo)志物，測定細(xì)胞中抗氧化酶的活力和細(xì)胞脂質(zhì)氧化水平，可以探究細(xì)胞的損傷情況。本研究采用的神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞系具有合成多巴胺和去甲腎上腺素能力，被廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制的研究[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，魚藤素干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平提升，并隨著魚藤素濃度的增加愈發(fā)明顯，說明魚藤素使SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，致使細(xì)胞抵御外界損傷能力減弱。

采用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)探究MAPK/ERK通路中的EGF、RAS、CREB、p-MEK和MEK蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)隨著魚藤素濃度的增加，對(duì)蛋白表達(dá)均有不同程度的抑制。結(jié)果說明，MAPK/ERK通路可能在魚藤素致SH-SY5Y細(xì)胞毒性中可能起關(guān)鍵作用。后續(xù)需要通過基因沉默技術(shù)與靶向抑制劑進(jìn)行深入的探究其是否為魚藤素產(chǎn)生神經(jīng)毒性的靶向信號(hào)通路。

綜上所述，魚藤素致SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性的機(jī)制可能是降低細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD和Gpx的活力，增加丙二醛MDA和活性氧ROS的生成，導(dǎo)致細(xì)胞不飽和脂肪酸過氧化。其中可能通過下調(diào)MAPK/ERK通路的相關(guān)蛋白表達(dá)使細(xì)胞活性受損，這為進(jìn)一步研究魚藤素的結(jié)構(gòu)改造與降低魚藤素毒性提供依據(jù)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科完成，特別感謝醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科各實(shí)驗(yàn)室老師的指導(dǎo)和幫助)