黃芪甲苷調控自噬減輕氧糖剝奪/復氧復糖PC12細胞氧化應激損傷研究

靳曉飛，張彐寧，周曉紅，高維娟

(河北中醫學院，河北省心腦血管病中醫藥防治研究重點實驗室，河北 石家莊 050200)

腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia/reperfusion injury，CIRI)是嚴重影響缺血性腦血管病溶栓治療效果的重要病理過程，其發生機制十分復雜，氧化應激損傷和氧自由基連鎖反應是腦缺血/再灌注引起二次損傷的關鍵因素[1]。自噬(autophagy)是細胞在應激條件下的一種自我保護過程，可將損傷的生物大分子或細胞器及時包裹、分解，產生新的能量物質，供細胞循環再利用，從而維持細胞自身穩態[2]。大量研究發現[3]，腦缺血/再灌注損傷可誘導自噬的發生，而激活自噬又可以減輕CIRI，提高神經元存活，發揮保護作用。中藥黃芪是臨床常用補氣要藥，因其補氣又兼活血之功，使氣盛則血行，瘀去而經脈通暢，目前在治療缺血性腦血管病方面效果明顯。黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ，AST)是黃芪的代表性活性單體成分，具有抗凋亡、抗衰老、抗病毒、抗炎等藥理作用[4-5]。本課題組前期細胞和動物實驗均證實，黃芪甲苷可上調自噬，減輕CIRI[6-7]，但其作用機制尚未完全闡明。本研究以在神經系統疾病體外研究應用廣泛的PC12細胞(類神經元)為實驗對象，在細胞水平，從自噬和氧化應激角度，探討黃芪甲苷拮抗CIRI的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞PC12細胞，亦稱為類神經元，經過NGF生長因子處理后具有神經元的生理特性，購買于BOSTER公司。

1.2 試劑和儀器主要試劑：黃芪甲苷購買于上海士峰生物公司，規格為20 mg/瓶，純度≥98%，生產批號為15082136；DMEM培養基(高糖)由Gibco公司生產；胎牛血清由杭州四季青生物公司生產；Earle’s平衡鹽溶液(無糖)由LEAGENE公司生產；胰蛋白酶、PBS緩沖液、青鏈霉素混合液由北京索萊寶生物公司生產；自噬抑制劑3-MA由Sigma公司生產；MDC法自噬檢測試劑盒購買于江蘇凱基生物公司；CCK-8試劑盒、ELISA試劑盒購買于北京莊盟國際生物公司；Beclin1兔抗大鼠單克隆抗體購買于Abcam公司。主要儀器：普通細胞培養箱3111型、三氣低氧培養箱3131型、多功能全波長讀數儀Varioskan LUX型由Thermo公司生產；透射電子顯微鏡H-7650型由HITACHI公司生產；全電動倒置熒光顯微鏡Axio Observer 7型由Zeiss公司生產。

1.3 細胞培養PC12細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基(高糖)培養，細胞置于普通培養箱(CO2培養箱)內正常培養，每3 d換液1次，細胞密度生長至70%～80%傳代。

1.4 氧糖剝奪/復氧復糖模型建立和實驗分組將對數期PC12細胞分為4組：正常組(Normal)、模型組(氧糖剝奪/復氧復糖組，Model)、黃芪甲苷組(AST)、自噬抑制劑+黃芪甲苷組(3-MA+ AST)。除了正常組之外，其余3組均需建立氧糖剝奪/復氧復糖模型：各組細胞棄去正常培養基(DMEM高糖培養基，含10%的胎牛血清)，換為Earle’s培養基(無糖)，模擬細胞缺血狀態，并將細胞立即放入三氣低氧培養箱(1%O2+94%N2+5%CO2，濕度適宜，37 ℃)，氧糖剝奪3 h。隨后，將細胞取出，更換培養基為正常細胞培養基，并將細胞放入普通培養箱繼續培養(即復氧復糖)12 h。其中，黃芪甲苷組、自噬抑制劑+黃芪甲苷組在復氧復糖開始的同時分別予以黃芪甲苷和自噬抑制劑3-MA +黃芪甲苷處理，黃芪甲苷作用濃度為100 μmol·L-1，自噬抑制劑3-MA作用濃度為5 mmol·L-1；正常組不做其他處理，正常培養即可。

1.5 CCK-8法檢測細胞活性將細胞以1×105個/mL密度接種至96孔板，普通培養箱培養24 h后，進行氧糖剝奪/復氧復糖造模和給藥處理。隨后，參照CCK-8試劑盒說明書步驟，給予CCK-8處理，普通培養箱孵育1 h。多功能全波長讀數儀(波長調整為490 nm)檢測各孔細胞吸光度值(即OD值)，OD值越大說明細胞活性越高。

1.6 ELISA法檢測MDA含量、SOD和GSH-Px活性將細胞以1×105個/mL密度接種至96孔板，普通培養箱培養24 h后，進行造模和給藥處理。隨后，對各組細胞消化、離心、PBS清洗，收集各組細胞，4 ℃條件下將細胞機械勻漿，離心，取各組細胞上清液，參照ELISA試劑盒說明書步驟，檢測各組細胞MDA含量、SOD和GSH-Px活性。多功能全波長讀數儀(波長調整為450 nm)檢測各孔細胞OD值。用標準物濃度和OD值繪制標準曲線，建立直線回歸方程式，計算各組細胞MDA、SOD、GSH-Px濃度。

1.7 透射電鏡觀察自噬小體變化對各組細胞消化、離心(1 000 r·min-1)、PBS清洗3次，隨后用2.5%的戊二醛對細胞進行固定4 h，清洗細胞3次。然后用1%的餓酸對細胞進行固定2 h，50%、70%、80%、90%、100%不同濃度的丙酮對細胞進行脫水2遍，包埋劑與丙酮不同比例滲透細胞，37 ℃和60 ℃恒溫箱對細胞進行聚合處理。超薄切片機切片(厚度為50 nm/片)，醋酸鈾和酸鉛雙染切片。透射電鏡觀察自噬小體，拍照，計算單位面積(μm2)自噬小體數量。

1.8 MDC熒光染色檢測自噬小體變化將細胞以1×105個/mL密度接種至24孔板，普通培養箱培養24 h，氧糖剝奪/復氧復糖造模和給藥處理。隨后，4%的多聚甲醛對細胞進行固定25 min，PBS清洗細胞3次，1×wash buffer清洗細胞3次。各孔加入MDC工作液100 μL，避光、室溫反應45 min，1×wash buffer 清洗細胞3次。倒置熒光顯微鏡觀察自噬小體(即熒光斑點)，拍照，計算單位面積(mm2)熒光斑點數量，熒光斑點數量越多說明自噬小體越多、自噬活動越強。

1.9 Western blot檢測Beclin1蛋白表達細胞裂解液裂解各組細胞，提取總蛋白，測定各組細胞蛋白含量。取60 μg樣品，加入Buffer緩沖液，混勻。100 ℃沸水處理10 min，蛋白變性。凝膠電泳分離，蛋白轉膜，5%的脫脂奶粉封閉1 h。隨后，加入Beclin1兔抗大鼠單克隆抗體(封閉液稀釋，1 ∶1 000)，4 ℃ 孵育過夜。TBST洗膜液清洗3次(10 min/次)，加入二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h。TBST洗膜液清洗3次，ECL化學發光顯色。β-actin作為內參。UVP軟件采集圖片結果，Image J軟件計算各組灰度值。

2 結果

2.1 黃芪甲苷對PC12細胞活性的影響與正常組相比，模型組細胞活性顯著降低(P<0.05)，表明細胞損傷較為明顯；與模型組相比，黃芪甲苷組細胞活性升高(P<0.05)，差異有統計學意義；自噬抑制劑可明顯拮抗黃芪甲苷提高細胞活性的作用(P<0.05)。見Fig 1。

Fig 1 Effect of astragaloside Ⅳ on viability of

2.2 黃芪甲苷對PC12細胞MDA、SOD、GSH-Px的影響與正常組相比，模型組MDA含量增多、SOD和GSH-Px活性下降(P<0.05)，提示有明顯的氧化應激損傷；與模型組相比，黃芪甲苷組MDA含量減少、SOD和GSH-Px活性升高(P<0.05)，差異有統計學意義；自噬抑制劑可明顯拮抗黃芪甲苷降低MDA含量、提高SOD和GSH-Px活性的作用(P<0.05)。見Fig 2。

Fig 2 Effect of astragaloside Ⅳ on MDA, SOD, GSH-Px of PC12 cells n=6)

2.3 黃芪甲苷對PC12細胞自噬小體的影響正常組未見自噬小體；模型組可見典型雙層膜結構的自噬小體，表明自噬被激活；與模型組相比，黃芪甲苷組自噬小體數量增多，差異有統計學意義(P<0.05)；自噬抑制劑可明顯拮抗黃芪甲苷提高自噬小體數量的作用(P<0.05)。見Fig 3。

2.4 黃芪甲苷對PC12細胞自噬熒光斑點的影響正常組自噬熒光斑點不明顯；模型組自噬熒光斑點數量增多(P<0.05)，提示自噬被激活；與模型組相比，黃芪甲苷組自噬熒光斑點數量增多(P<0.05)，差異有統計學意義；自噬抑制劑可明顯拮抗黃芪甲苷提高自噬熒光斑點數量的作用(P<0.05)。見Fig 4。

2.5 黃芪甲苷對PC12細胞Beclin1蛋白表達的影響與正常組相比，模型組自噬標志蛋白Beclin1表達增多(P<0.05)；與模型組相比，黃芪甲苷組Beclin1蛋白表達增多，差異有統計學意義(P<0.05)；自噬抑制劑可明顯拮抗黃芪甲苷提高Beclin1蛋白表達的作用(P<0.05)。見Fig 5。

Fig 3 Effect of astragaloside Ⅳ on autophagosomes of PC12 cells n=6)

3 討論

缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease)是一類常見的腦血管疾病，具有發病率高、致殘和致死率高的特點，其發病已逐漸呈現年輕化的趨勢，嚴重影響人類健康和生活。腦缺血/再灌注損傷是針對缺血性腦血管病恢復或重建缺血區血液灌注時而出現的一類重要病理損傷。腦缺血發生后，及時恢復缺血腦組織血流，再灌注可有效減輕腦組織損傷和神經功能障礙，但是再灌注期間可產生大量的活性氧，引起超氧化物自由基、羥基自由基、過氧化氫等增多，造成DNA損傷、蛋白質和脂質氧化，最終引起或加重神經元損傷[8]。活性氧極易侵襲細胞膜上的脂質，導致脂質發生過氧化，產生大量脂質過氧化物，引起細胞膜通透性、結構和功能發生改變。丙二醛(malonaldehyde，MDA) 作為脂質過氧化反應的最終產物，被認為是檢測氧化應激損傷的重要參考指標[9]。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是一種重要的抗氧化酶，可阻止脂質發生過氧化，并促進H2O2分解為無毒害作用的H2O，保護細胞膜的結構和功能[10]。超氧化物歧化酶(SOD)作為清除活性氧的主要酶類，可直接反映細胞的抗氧化能力。SOD能夠促進細胞內超氧陰離子和氫離子發生反應，生成O2和H2O2，其中H2O2在GSH-Px的作用下可分解成O2和H2O，從而有效抵抗氧化應激損傷[11]。

Fig 4 Effect of astragaloside Ⅳ on autophagic fluorescent spots of PC12 cells n=6)

Fig 5 Effect of astragaloside Ⅳ on Beclin1 protein expression of PC12 n=6)

自噬是真核生物細胞在不斷進化過程中的一種高度保守的重要分解代謝過程。為實現細胞本身代謝需要和維持內環境穩態，細胞內脫落的內質網膜或高爾基體膜可將老化、受損或異常的生物大分子和細胞器包裹，形成雙層膜結構的自噬小體，最終在溶酶體的降解作用下，產生新的能量物質，供細胞循環再利用。

由于被降解的生物大分子和細胞器轉運到溶酶體的方式不同，可將自噬分為3種類型：微自噬、巨自噬、分子伴侶介導的自噬，而巨自噬目前研究最為廣泛和深入。細胞自噬受多種自噬相關基因的調控，其中Beclin1基因是調控自噬的特異性基因。Beclin1基因亦稱為BECN1基因，是酵母菌ATG6基因在哺乳類生物中的同系物，有4個結構域：BH3結構域、進化保守結構域、卷曲螺旋結構域、核輸出結構域。Beclin1基因可通過這些結構域形成相應復合體，誘導其他自噬基因定位在自噬體膜，調控自噬小體的形成，介導自噬活動。因此，Beclin1基因和自噬小體常作為檢測自噬活動的重要依據。大量研究證實，腦缺血/再灌注可誘導Beclin1表達增多，促進自噬小體形成；應用自噬抑制劑3-MA處理后，Beclin1表達減少，自噬小體數量減少，神經元存活率升高，提示自噬可拮抗腦缺血/再灌注損傷[12-13]。

中藥黃芪最早記載于《神農本草經》，有補氣藥中“耆長”、“補氣諸藥之最”的美譽，收錄于歷版《中華人民共和國藥典》和全國統編《中藥學》規劃教材。大量文獻記載，黃芪不僅具有補氣的功效，還具有活血化瘀、通絡止痛的作用，在治療缺血性腦血管病方面效果良好，應用廣泛。中國中藥化學成分數據庫顯示，黃芪的化學成分包括黃芪皂苷、黃芪黃酮、黃芪多糖、氨基酸、微量元素等70余種有效物質成分。黃芪甲苷是黃芪皂苷中的代表性活性單體成分，具有抗炎、抗衰老、抗凋亡、抗病毒、促進能量代謝和干細胞增殖等生物作用，是檢測黃芪質量優劣的重要參考指標[14-15]。本課題組一直致力于黃芪及其有效成分防治缺血性腦血管病方面的研究。我們前期研究發現，黃芪甲苷可通過上調自噬抑制腦缺血/再灌注損傷，發揮神經保護作用，但其作用機制尚未完全闡明，亟待明確。本實驗以PC12細胞作為研究對象，通過氧糖剝奪/復氧復糖模型模擬建立神經元體外缺血/再灌注損傷，在細胞水平，從調控自噬和氧化應激角度，探討黃芪甲苷拮抗腦缺血/再灌注損傷的具體作用機制。實驗結果發現，氧糖剝奪/復氧復糖可誘導自噬激活，同時也引起了氧化應激損傷；當黃芪甲苷干預后，自噬活動增強，氧化應激損傷減輕，提示黃芪甲苷可上調自噬，并抑制氧化應激損傷；當自噬抑制劑3-MA、黃芪甲苷同時干預，自噬活動變弱，氧化應激損傷加重，表明黃芪甲苷可通過上調自噬，減輕氧糖剝奪/復氧復糖誘導的PC12細胞氧化應激損傷，發揮保護作用。

最后，需要指出的是，自噬具有“雙刃劍”的作用，自噬過度激活可引起自噬性細胞損傷甚至死亡，這可能與疾病的發展過程、損傷程度、干預條件、預后轉歸等因素有關，因此如何更加全面地認識自噬，精準地調節自噬，充分發揮其保護作用，將是我們進一步努力和探索的方向。

(致謝：本實驗在河北省心腦血管病中醫藥防治研究重點實驗室完成，謝謝！)