丹皮酚對小鼠酒精性脂肪肝中Adip/CaMKKβ/AMPK通路的影響

司遠青，顏貴明

(安徽中醫藥大學中西醫結合學院病原生物學與免疫學教研室，安徽 合肥 230012)

酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease，AFLD)是指由于長期大量飲酒導致的肝臟脂肪代謝異常的疾病。當人攝入酒精時，進入機體的大部分酒精會在肝臟被代謝，影響肝臟脂肪代謝，最終導致肝內的脂肪堆積，脂肪變性、壞死，形成脂肪肝，甚至進一步形成肝炎或肝纖維化等。

腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)作為外周組織中能量平衡的主要傳感器，當能量代謝的平衡被打破時，其將被磷酸化并激活[1]。AMPK信號一旦被激活，就會抑制能量生物合成途徑和活化能量代謝途徑。McCullough等[2]就提出了代謝應激可引起AMPK的變化。SREBP1c(固醇調節元件結合蛋白1c)做為AMPK其中一個下游蛋白激酶，參與脂肪酸的合成與代謝[3]。CaMKKβ(鈣調蛋白激酶)，涉及能量平衡調節，做為AMPK上游激酶，可以通過其磷酸化來激活AMPK。有研究將小鼠的CaMKKβ基因敲除可免受飲食引起的肥胖、胰島素抵抗和葡萄糖耐受等的影響[4]。脂聯素(adiponectin，Adip)作為脂肪細胞分泌的一種具有生物活性的蛋白質因子，可參與調節體內能量代謝[5]。丹皮酚(paeonol，Pae)是從毛茛科植物牡丹干燥根皮中提取出的一種有效的成分，具有抗炎、抗氧化、降脂質、抑制脂肪過氧化等多種作用。本課題組前期研究發現，丹皮酚對AFLD大鼠有較好的治療作用，可以減輕酒精引起的肝細胞損傷[6]，但是否通過Adip/CaMKKβ/AMPK這一通路發揮作用尚不清楚。本實驗擬從該通路入手研究丹皮酚治療小鼠酒精性脂肪肝的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 8周齡健康♂ KM小鼠，SPF級，體質量(40±2)g。由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，生產許可證號: SCXK(蘇) 2016-0010。小鼠自由進食、飲水，標準飼料喂養，實驗室常規適應性飼養1周。

1.1.2藥物與試劑 丹皮酚(paeonal，Pae)，南京澤郎生物科技有限公司，批號：ZL150806；水飛薊賓(silibinin，Sil)膠囊，天津天士力圣特制藥有限公司，批號：750705069；56度永豐牌二鍋頭，北京二鍋頭酒業股份有限公司，批號：SC11511150818017；蘇木素-伊紅(HE)染色液，北京雷根生物，批號：0419A18；IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒，上海一研生物科技有限公司，批號：201812；甘油三酯(TG)和總膽固醇(T-CHO)測試盒，南京建成生物工程研究所，批號：20181208；ALT和AST試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號：20181207；小鼠脂聯素(APN/ADP)ELISA試劑盒，酶免商城，批號：MM-0547M2；小鼠乙酰輔酶A羧化酶(ACC)ELISA試劑盒，酶免商城，批號：MM-0757M2；Fast Quant RT Kit(with gDNase)，天根生化科技(北京)有限公司，批號：04214；Trizol試劑盒，Invitrogen公司，批號：184608；β-actin、AMPKα、CaMKKβ、AdipR1和SREBP1c引物購于上海生工。兔抗β-actin、AMPKα、CaMKKβ、P-AMPKα、P-CaMKKβ、AdipR1和SREBP1c一抗及二抗(羊抗兔)購于Affinity公司。

1.1.3主要儀器 YD-315切片機(金華市益迪醫療設備有限公司)；YD-AB生物組織攤烤片機(金華市益迪醫療設備有限公司)；TS-12A生物組織自動脫水機(湖北省孝感市宏業醫用儀器有限公司)；YD-6L生物組織冷凍包埋機(金華市益迪醫療設備有限公司)；OLYMPUSBX51正置顯微鏡(上海富萊光學公司)；K3型酶標儀(LabServ公司)；Thermo ABI 7500 實時熒光定量PCR儀(美國應用生物系統公司); FCM型凝膠成像儀(美國proteinsimple公司)；基因擴增儀(杭州柏恒科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1AFLD小鼠模型的復制[7]110只KM ♂小鼠隨機分為兩組：空白對照組(Control)和模型組，前者10只，后者100只。空白對照組灌胃生理鹽水，模型組灌胃56度白酒，灌胃體積為12 mL·kg-1，每天上午灌胃1次。1周后，每天取模型組小鼠2只處死，肉眼觀察肝臟變化，并留取肝臟做病理切片，觀察肝臟病變情況。與空白對照組小鼠相比，造模2周后，小鼠肝臟病理切片有明顯的脂滴空洞，符合AFLD的特征。剩余小鼠繼續下述實驗。

1.2.2動物分組與給藥 造模成功的小鼠隨機分為以下3組：模型組(EtOH 12 mg·kg-1)、陽性藥組(Sil+ EtOH 23 mg·kg-1)和丹皮酚組(Pae+EtOH 300 mg·kg-1)，灌胃體積12 ml·kg-1，10只正常對照組小鼠給予等體積的生理鹽水，均連續干預1周。

1.2.3小鼠活動狀態觀察 每日觀察小鼠的外觀、毛色、活動、食量、排便等狀態，每隔1 d稱一次體重。

1.2.4標本處理及指標檢測 藥物干預1周后，取材前一晚禁食不禁水。次日上午稱重、麻醉、摘眼球取血。取完血后立即摘取肝臟，用冷的生理鹽水清洗肝臟表面后，將肝臟分為三部分，第一部分用10%中性福爾馬林浸泡用于病理檢測，第二部分和第三部分于-80 ℃保存，用于后期PCR實驗和Western blot蛋白印跡實驗。

1.2.5血清生化指標檢測 在末次給藥2 h后，水合氯醛麻醉，摘眼球取血，靜置2 h后，3 000 r·min-1離心10 min,取上層血清，-20℃保存。用于血清TG、TC、ALT、AST、IL-6、IL-1β、TNF-α、Adip和ACC的含量測定。上述血清學檢測皆按照相應試劑盒測定。

1.2.6組織病理學檢測 取出在10%中性福爾馬林中固定的肝組織，脫水，常規石蠟包埋，切片，HE染色。200倍光學顯微鏡下觀察肝組織的形態學方面的改變。

1.2.7基因水平檢測

1.2.7.1 小鼠肝臟組織中的RNA提取 末次給藥后，禁食不禁水18 h后麻醉，迅速取出肝臟，預冷的生理鹽水清洗，研磨，按照Trizol試劑盒的要求提取小鼠肝臟的總RNA。取5 μL總RNA加入95 μL ddH2O混勻，分別測定OD260、OD280的值，OD260/OD280值均在1.8～2.0之間。再通過公式：RNA濃度(g·L-1)=(OD260×40×稀釋倍數)/1 000來計算RNA的濃度，使用無菌RNase水將濃度調至一致。

1.2.7.2 cDNA合成 使用Fast Quant RT Kit(with gDNase)此試劑盒，根據說明書要求：在冰浴的nuclease-free管中分別加入total RNA 3 μL、5×g DNA Buffer 2 μL和RNase-Free ddH2O 5 μL徹底混勻，簡短離心，置于42 ℃，孵育3 min。再加入以下試劑的混合物：10×Fast RT Buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 1 μL、FQ-RT Primer MIX 2 μL 和 RNase-Free ddH2O 5 μL。充分混勻后，42 ℃，孵育15 min；95 ℃，孵育3 min，即得到cDNA；之后置于冰上放置。

1.2.7.3 引物設計 所有引物采用Primer Premier 5.0軟件設計，委托上海生工生物有限公司合成，各引物序列見Tab 1。引物開蓋前先4 000 r·min-1, 30～60 s離心。輕輕開蓋后加入相對應體積的DEPC水混勻，得到100 μmol·L-1的引物。將其稀釋10倍分裝，置于-20 ℃保存備用。

1.2.7.4 半定量PCR 取nuclease-free管置于冰盒上，按照試劑盒要求配制反應體系：Easy Taq PCR SuperMix(2×)12.5 μL,引物f (10 μmol·L-1) 0.5 μL, 引物r(10 μmol·L-1) 0.5 μL, DEPC水11 μL, cDNA 0.5 μL。將混合均勻的反應體系混合液瞬時離心去除氣泡后，放置于基因擴增儀上進行反應，反應程序：94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、 72 ℃ 30 s，35個循環;72℃ 10 min之后進行瓊脂糖凝膠電泳，電壓110 V，時間27 min，于凝膠成像儀曝光成像。

1.2.7.5 實時熒光定量PCR 取nuclease-free管置于冰上，按照試劑盒要求配制反應體系：SYBR Green qPCR Master Mix(2×)12.5 μL,引物f(10 μmol·L-1) 1 μL, 引物r(10 μmol·L-1)1 μL, DEPC水10 μL, cDNA 0.5 μL。將混合均勻的反應體系混合液瞬時離心去除氣泡后，放置于ABI 7500實時熒光定量PCR儀上進行反應，反應程序：95 ℃ 1 min; 95 ℃ 15 s、50 ℃ 15 s、 72 ℃ 45 s，40個循環; 95 ℃ 15 s; 60 ℃ 1 min.實驗重復3次，內參基因為β-actin，目的基因為AdipR1、CaMKKβ、AMPKα和SREBP1c。分別測定上述基因的Ct值，計算各基因各組的Ct值平均值，實驗結果表示為：2-△△Ct。

Tab 1 Primer sequences of PCR

1.2.8蛋白水平檢測

1.2.8.1 小鼠肝組織蛋白提取 從-80 ℃冰箱中取出冰凍的肝組織，各組約100 mg，剪碎，按照試劑盒說明書對組織進行蛋白抽提，得到各組總蛋白后，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，蛋白存于-20℃備用。

1.2.8.2 Western blot檢測蛋白水平表達 采用10% SDS-PAGE膠進行電泳，濕法轉模；5% BSA室溫封閉2 h，TBST緩沖液洗滌4次，每次5 min；一抗分別按照β-actin(兔抗，1 ∶1 000)、AdipR1(兔抗，1 ∶1 000)、CaMKKβ(兔抗，1 ∶1 000)、p-CaMKKβ(兔抗，1 ∶500)、AMPKα(兔抗，1 ∶1 000)、p-AMPKα(兔抗，1 ∶500)、SREBP1c(兔抗，1 ∶1 000)用5%BSA稀釋，把對應的膜浸沒在對應的一抗中，4 ℃孵育過夜；取出后，TBST緩沖液洗滌4次，每次5 min；二抗(羊抗兔，1 ∶10 000)室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌4次，每次5 min；顯影曝光。

2 結果

2.1 動物一般狀態觀察造模2周，模型組小鼠出現毛色灰暗無光澤，活動量減少，小鼠體質量減輕；正常對照組小鼠毛色光滑，活動積極，食量與排便正常；給藥1周后，各給藥組毛色略有改善，活動量與精神狀態也略有改善。各組小鼠體質量(Fig 1)有變化，但無統計學意義。

Fig 1 Line chart of mouse weight

2.2 肝臟組織病理學變化如Fig 2顯微鏡所示，正常組肝細胞結構正常，內無脂滴形成，肝細胞無脂肪變性；模型組小鼠肝細胞中出現小而密的脂滴，炎性細胞浸潤，肝細胞出現脂肪變性；水飛薊賓組幾乎未存在圓形的脂滴空洞和炎性細胞；丹皮酚組有較水飛薊賓組略多的圓形脂滴空洞和炎性細胞浸潤。水飛薊賓與丹皮酚都在一定程度上減輕肝細胞的脂肪變性與炎性細胞浸潤。

Fig 2 Histopathological features of liver(HE×200)

2.3 丹皮酚對血清中TG、TC 含量的影響模型組小鼠血清中TG與TC含量明顯高于正常組；兩個用藥組皆有不同程度的改善模型組的升高情況，但就TG含量上，丹皮酚比水飛薊賓降低；TC含量上，兩用藥組差異無顯著性。可見丹皮酚能更有效地降低酒精誘導導致的酒精肝中甘油三酯的含量。見Fig 3。

Fig 3 Effect of Pae on TG and TC in mice with alcoholic fatty

2.4 丹皮酚對血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量的影響酒精誘導小鼠AFLD模型，血清中IL-6含量幾乎無變化，IL-1β和TNF-α皆有升高；水飛薊賓組與丹皮酚組調節上述3種炎癥因子差異無顯著性，血清中IL-6含量依然幾乎無變化，IL-1β與TNF-α對酒精誘導引起的含量升高情況有明顯改善。見Fig 4。

Fig 4 Effect of Pae on IL-6, IL-1β and TNF-αin mice

2.5 丹皮酚對血清中Adip和ACC含量的影響通過ELISA試劑盒檢測，模型組小鼠血清中Adip含量低于正常組，給予水飛薊賓和丹皮酚給藥組可改善模型組Adip含量降低情況，但仍與正常組差異有顯著性。同時對血清中ACC進行檢測，相對于正常組，模型組小鼠血清中ACC含量升高，兩給藥組皆降低ACC含量，且水飛薊賓組比丹皮酚組更大程度降低其含量。見Fig 5。

Fig 5 Effect of Pae on Adip and ACC in mice with alcoholic fatty

2.6 丹皮酚對肝臟組織中AdipR、CaMKKβ、AMPK和SREBP1c核酸水平的影響與正常組相比，模型組與兩用藥組AdipR1皆無差異，見Fig 6。對于CaMKKβ和AMPKα，與正常組相比，模型組皆降低(Fig 6A)，分別下調6.223和5.071倍，水飛薊賓組分別下調1.618和1.893倍，丹皮酚組分別下調2.902和2.900倍(Fig 6B)，明顯改善模型組下調情況。對于SREBP1c，與正常組相比，模型組皆上升(Fig 6A)，上調5.702倍，水飛薊賓組上調1.797倍，丹皮酚組下調2.779倍(Fig 6B)，顯著改善模型組上調情況。

2.7 丹皮酚對肝臟組織中AdipR1、CaMKKβ、AMPKα、SREBP1c蛋白水平的影響從Fig 7結果可知，與正常組相比，模型組與兩用藥組AdipR1皆差異無顯著性。對于磷酸化CaMKKβ和AMPKα，與正常組相比，模型組皆降低；水飛薊賓組和丹皮酚組皆改善酒精誘導引起的該蛋白磷酸化水平表達下調現象，同時，水飛薊賓比丹皮酚更大程度改善此現象。而對于SREBP1c，與正常組相比，模型組該蛋白表達上升，水飛薊賓組與丹皮酚組皆有一定程度下調，明顯改善模型組上調情況，且兩用藥組差異無顯著性。結合核酸水平與蛋白水平的結果(Fig 6，Fig 7)，丹皮酚與水飛薊賓皆可通過對Adip/CaMKKβ/AMPK信號轉導的調節來改善小鼠酒精性脂肪肝。

3 討論

AMPK系統是細胞能量狀態的傳感器，AMPK的α亞基一旦被激活，AMPK就會同時抑制能量消耗的生物合成途徑和產ATP的分解代謝途徑。AMPK若被抑制則促進肥胖患者的脂肪生成增加，膽固醇和糖原合成增加，糖原異生，而脂肪酸氧化和血清葡糖糖攝取過程減少[8]。有研究表明，在HeLa細胞中，增加的[Ca2+]激活CaMKKβ/AMPK通路，其參與黃芩苷對體內肝臟脂肪變性和肥胖的發展的保護作用[9]。減少脂肪細胞中的cAMP積累可改善乙醇刺激的脂肪脂解，這個過程和Ca2+/CaMKKβ/AMPK信號傳導的調節相關，從而阻止脂肪酸從頭合成與轉運。

同時有研究稱，AMPKα激活可抑制SREBP1c，有助于多酚和二甲雙胍在高糖加胰島素條件下抑制肝細胞中SREBP1c的蛋白水解切割和核轉位的能力，降低飲食誘導的肝臟和血漿中TG和TC水平[9]。SREBP1c是與其靶基因(如FAS，ACC和SCD-1)結合的關鍵轉錄因子，可從而引發肝臟脂肪生成。以前有研究表明，果糖可通過上調SREBP1c，FAS，SCD-1和ACC1的表達來促進脂肪生成[10-11]。AMPKα抑制SREBP1c轉位到細胞核中，以此來下調脂肪生成相關基因的表達[12]。

Fig 6 Expression of AdipR, CaMKKβ, AMPKα and SREBP1c genes in mice with alcoholic fatty

Fig 7B Expression of AdipR, CaMKKβ, AMPKα and SREBP1c in mice with alcoholic fatty

本次實驗，我們發現在酒精誘導引起的小鼠酒精肝中，核酸水平上的CaMKKβ與AMPKα表達被抑制，SREBP1c表達卻是上調；蛋白水平上，CaMKKβ和AMPKα的磷酸化被抑制，SREBP1c表達量增加。可見CaMKKβ活化后可誘導AMPK活化，而AMPK活化會抑制SREBP1c表達。在小鼠AFLD中，CaMKKβ和AMPKα表達被抑制，從而AMPK對SREBP1c表達的抑制作用就相對被減弱，導致脂肪分解代謝障礙而引起脂肪變性。這與一些文獻報道的結果一致。同時，不管是核酸水平還是蛋白水平都驗證了丹皮酚可一定程度的改善酒精誘導引起的上述情況。

本實驗中，小鼠肝臟組織中AdipR1 的mRNA水平無變化，在蛋白水平上，僅模型組出現略微上升，而在ELISA檢測中Adip水平出現明顯下降。正如You等[13]提出，Adip有AdipR1和 AdipR2兩個受體，作為Adip介導的信號傳導，導致脂肪酸氧化增加，并減少包括肝臟在內的多個器官的脂肪積累，主要通過AdipR2，AdipR1幾乎無顯著性變化。在AFLD大鼠模型中，肝臟AdipoR2在mRNA和蛋白表達，以及血清總Adip表達均降低[14]。綜上所述，本實驗從核酸水平和蛋白水平驗證了丹皮酚對AFLD小鼠的保護作用與Adip/CaMKKβ/AMPK這條信號轉導調節有關。同時水飛薊賓作為陽性對照藥也可能通過干預了此信號轉導來對AFLD小鼠肝損傷進行保護作用，丹皮酚與水飛薊賓二者對上述信號轉導的調節保持一致，但在甘油三酯含量上，丹皮酚比水飛薊賓更有效降低AFLD小鼠的甘油三酯水平。

有文獻報道[14]，Adip可抑制脂多糖刺激Kupffer細胞和小鼠巨噬細胞中TNF-α的產生，Adip和TNF-α聯合可抑制脂肪細胞中的基因表達，蛋白質合成和產生。在酒精性肝損傷早期階段，大鼠血清中的TNF-α增加，對于Adip的酒精誘導的抑制作用可以通過增強TNF-α產生來介導，其反過來可以通過旁分泌或內分泌機制抑制脂肪組織中的Adip表達。因此，Adip產生的失調可導致多種肝臟問題，包括脂肪變性，這是酒精性肝病的早期階段。同時有臨床隨機對照實驗報道稱[15]，NAFLD患者Adip水平降低與炎癥因子(如TNF-α)增加相關，姜黃素可減少脂肪組織的巨噬細胞浸潤，增加Adip的產生并抑制肝臟炎癥因子。本實驗結果得出，AFLD小鼠血清中的Adip水平下降，TNF-α水平提高，與上述文獻報道一致。因此，本實驗在研究丹皮酚治療小鼠AFLD的作用機制中，Adip/CaMKKβ/AMPK該通路參與此過程，對酒精性脂肪肝治療提供理論依據。但本實驗未在AFLD進展過程中的個時間段進行驗證，未能充分確定Adip/CaMKKβ/AMPK這條信號轉導和炎癥因子的表達水平的變化與疾病發生發展的因果關系。因此，本實驗后期將針對疾病繁盛發展過程各時間節點的此信號轉導的變化來進一步驗證。