基于網絡藥理學的荊芥揮發油主要成分抗炎機制研究

袁 岸，劉 淇，饒志粒，曹海娟，劉小波，呂紅君，曾 南

(成都中醫藥大學藥學院 中藥材標準化教育部重點實驗室省部共建西南特色中藥資源國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137)

荊芥為唇形科植物荊芥(SchizonepetatenuifoliaBriq.)的干燥地上部分，性微溫、味辛，歸肺、肝經。其具有解表散風，透疹消瘡之功效，用于感冒、頭痛、麻疹、風疹等病癥的治療，歷史悠久，功效顯著。臨床上荊芥常配伍其它解表藥共奏發汗解表功效，為發散藥中藥性最平和之品。“辛”是解表藥的共同藥性特點，揮發油是辛味藥藥性的主要物質基礎，荊芥揮發油(essential oil fromSchizonepetatenuifoliaBriq.，EOST)是荊芥的主要有效物質基礎之一，近年來,本課題組圍繞“荊芥揮發油是荊芥發揮解表功效的重要物質基礎”的思路開展相關研究。抗炎是解表藥的主要藥理作用之一，課題組對EOST抗炎作用的研究較為深入，發現其通過影響花生四烯酸(arachidonic acid，AA)代謝、Toll 樣受體信號(TLR)通路、氧化反應以及NLRP3炎癥小體調控以發揮作用[1]，然而這樣多成分組合的作用機制研究仍較為復雜，揮發油發揮藥理作用的機制研究較少，需進一步深入研究并完善。

單成分的研究難以全面解釋中藥多組分-多靶點-多途徑的作用機制，是目前中藥現代化研究所面臨的重要困難。近年來，整體研究中藥作用機制方法的提出與結合，如網絡藥理學、系統藥理學及組學，推進了中藥及復方的深入研究。網絡藥理學于2008 年由 Hopkins[2]提出，是基于系統生物學和多向藥理學的研究方法，通過構建藥物與基因、靶標和疾病等之間的相互作用網絡，來探討藥物的作用機制。因中藥對機體的作用是一個復雜的生物學網絡，該方法與中醫藥“整體性”特點一致[3]。目前，網絡藥理學已被應用于中藥復方的配伍規律、復方優化、新藥開發、中藥活性成分篩選和藥物-癥候研究等方面。其為復雜的中藥研究提供了重要的方法，將網絡生物學和藥物信息學的研究手段用于中藥物質基礎和作用機制研究，分析中藥成分-靶點-疾病關系，進一步闡釋中藥的科學內涵。本研究采用網絡藥理學方法，建立EOST主要成分-靶點網絡圖預測其發揮抗炎作用的活性成分和作用靶點，通過基因本體(gene ontology，GO)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析其作用特點，蛋白質相互作用分析關鍵靶點，分子對接驗證成分與炎癥靶點結合情況以得到抗炎有效成分，并結合已有文獻報道來驗證預測結果，為進一步機制研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 構建小分子化合物結構數據庫EOST中化學成分主要為單萜類、倍半萜類，還含有醛、酮、醌、酚、醇、酯、羧酸、烯烴及烷烴類等化合物，分析近年文獻，整理得到108個化學成分。依據課題組前期GC-MS檢測的EOST主要化學成分組，提取含量0.1%以上的17個成分[1]，見表1。以這17個成分為研究對象，組成發揮藥理作用的主要部分。通過中藥系統藥理數據庫和分析平臺(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php )、PubChem數據庫檢索17個分子結構，構建其小分子結構數據庫，以.sdf 格式保存。根據Lipinski類藥五原則，小分子藥物應滿足：①氫鍵供體數目≤5；②相對分子質量≤500；③脂水分配系數logP≤5；④氫鍵受體數目≤10；⑤可旋轉鍵數目不超過10。通過SwissADME在線平臺(http://www.swissadme.ch/ )分析類藥性，這17個成分均符合類藥五原則。

Tab 1 Main constituents in EOST[1]

1.2 確定藥物靶點從TCMSP中檢索化合物靶點，在此基礎上，結合Swiss Target Prediction在線平臺對未檢索到的化學成分進行靶點預測，該平臺通過輸入成分與數據庫中已知成分相似度預測其靶點，選取預測結果中參數Probability≥0.7的靶點，做進一步分析。然后從UniProtKB(http://www.uniprot.org)中提取基因名稱。

1.3 目標基因GO富集分析GO分析是為了研究所涉及靶點基因參與的細胞組分(cellular component ，CC，描述基因產物在細胞中的位置，如內質網、核或蛋白酶等)，生物過程(biological process，BP，具有多步驟的有序生物過程，如細胞生長分化、維持、凋亡及信號傳導等)和分子功能(molecular function，MF，單基因產物的功能，如結合活性或催化活性等)。目前，大多數網絡藥理學研究以研究的某幾個靶點為中心進行GO分析，但中藥多成分-多靶點-多途徑的特點造成其發揮作用的復雜性，一些看似不相關的靶點或途徑同樣可能影響到所研究的靶點。尤其是炎癥，與很多疾病有重要聯系，在GO分析中有必要將全部靶點基因也納入研究范圍。因此采用主要成分對應所有靶點基因進行整體分析，使用DAVID 6.8(https://david-d.ncifcrf.gov/)在線功能注釋工具進行GO富集分析。以錯誤發現率FDR≤0.05為標準篩選。從DAVID獲得該部分靶點所涉及的GAD數據庫疾病。

1.4 網絡構建與分析為了解EOST主要化學成分的分子機制，使用Cytoscape 3.7.1構建化合物-靶點網絡。通過Cytoscape軟件中的ClueGo對靶點進行KEGG 通路分析，選擇富集得到的KEGG通路的P<0.05，可視化得到KEGG通路網絡圖。為研究靶標蛋白之間的聯系，運用STRING對上述靶點研究得到蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)數據結果，將該部分數據輸入Cytoscape可視化獲得PPI圖，該圖能直觀分析關鍵蛋白。

1.5 分子對接驗證關鍵靶標蛋白考慮到已有成分數據庫的局限性，需要通過網絡中所獲得的炎癥靶點進行分子對接，進一步確定各成分對靶點的作用。根據成分-靶點網絡和蛋白PPI數據分析，以Homo sapiens為基源從Uniprot和RCSB PDB(該靶點在Uniprot結構中列出，并在PDB數據庫中匹配值最高者納入)篩選網絡中與炎癥相關的各靶點蛋白，提取對應的PDB ID。SystemsDock在線對接網站基于docK-IN評分預測配體和受體結合力，每次可對接5個小分子，所選擇的靶標蛋白盡量選擇確定活性位點的蛋白，其中有Native legend可以作為統一參考，保證同樣的蛋白對接不同批次的小分子能得到相對可比較的得分。將“1.1”建庫所得活性成分分別輸入SystemsDock在線對接工具進行分子對接，與炎癥相關靶點腫瘤壞死因子-α(TNF，PDB ID：3IT8)、白介素-6(IL-6，PDB ID：4NI7)、白介素-1β(IL-1β，PDB ID：2NVH)、白介素-10(IL-10，PDB ID：2ILK)、前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2，PDB ID：5F19)、前列腺素內過氧化物合酶1(PTGS1，PDB ID：5WBE)、毒蕈堿型膽堿受體M1(CHRM1，PDB ID：5CXV)、煙堿型膽堿受體α7(CHRNA7，PDB ID：5AFM)初步驗證可能的作用靶點。根據得分和連接位點分析化學成分與各靶點相互作用情況。

1.6 整理相關文獻資料在前述網絡構建-KEGG、GO、PPI分析-分子對接驗證基礎上，查詢國內外文獻關于EOST及得分較高的主要成分抗炎作用研究，對本研究補充已有文獻資料。

2 結果

2.1 EOST化學成分-作用靶點網絡構建分析網絡的拓撲結構性質，本研究中17個主要成分，其中除2-環己烯-1-酮、8,9-去氫百里香酚、辣薄荷酮和1-辛烯-3-醇乙酸酯這4個成分沒有對應潛在靶點。整個網絡中有13個成分，45個靶蛋白，共58個節點，節點之間形成116條邊。如Fig 1，PTGS2、PTGS1、CHRM1、CHRM2、CHRM3、GABRA1、GABRA2、GABRA6、SLC6A2、ADRA1B、ADRA2A、NCOA2等為主要的靶點。靶點中有20個靶點(44.44%)對應兩個以上小分子。該網絡體現了EOST多成分-多靶點-多途徑調節疾病的特點。

2.2 蛋白間相互作用關系通過STRING平臺進行蛋白間相互作用(PPI)分析， PPI網絡能更好分析EOST主要成分的作用機制。輸入Cytoscape軟件可視化得到Fig 2，顏色越深表示節點蛋白的節點程度越大，重要性越大。在PPI網絡中獲得總共111個相互關系以及36個相關目標。如Fig 2所示，IL-6、TNF、IL-1β、SLC6A4、PTGS2、ADRB2、ADRA1B、CHRM2、CHRM1等均顯示突出作用。其中IL-6、TNF、IL-1β、IL-10、PTGS2均是炎癥通路的重要靶點，CHRM1、CHRNA7、BCHE均是膽堿能抗炎通路的重要靶點，因此也可能是EOST發揮抗炎作用的靶點之一。

Fig 1 Components-target network of EOST

Fig 2 Target protein-protein interactions (PPI)

2.3 EOST 的KEGG通路分析按P<0.05富集到29條通路，可視化得到Fig 3。形狀越大表明所占比例越大，其重要性也越大。Fig 3表明EOST與炎癥的關系主要與NF-κB通路(涉及靶點為TNF、IL-1β、PTGS2、BCL2)、IL-17信號通路(涉及靶點為IL-1β、 IL-6、PTGS2、TNF)有關，同時也與炎癥性腸病(inflammatory bowel disease)，小細胞肺癌(small cell lung cancer)，利什曼病(leishmaniasis)，百日咳(pertussis)，軍團菌病(legionellosis)等炎癥或呼吸道相關疾病有重要聯系，提示其對這類疾病可能有一定治療作用。近年來，隨著神經-體液調節關系的研究發現，膽堿能抗炎通路同樣調節機體炎癥反應，而且更迅速。揮發油類成分易透過血腦屏障，可作用于腦部受體發揮作用。由Fig 3可知EOST對神經調節通路有一定作用：神經活性配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)，膽堿能(cholinergic synapse)，尼古丁(nicotine addiction)，嗎啡(morphine addiction)，γ-氨基丁酸(GABAergic synapse)。

2.4 GO富集分析EOST主要成分涉及的基因功能為14個(FDR≤0.05)，見表2。以CC結果最多，表明其作用部位可能在突觸、GABA-A受體復合物、質膜、細胞連接、氯離子通道復合體等，BP涉及藥物反應、γ-氨基丁酸通路、糖皮質激素反應、膽堿能突觸傳遞等，MF涉及胞外配體門控離子通道活性、GABA-A受體活性、藥物結合等。根據DAVID分析得GAD疾病信息，提取前20相關疾病信息見表3，表明這些靶點可能與酒精濫用、2型糖尿病、精神疾病、感染、炎癥、貪食癥、高膽固醇血癥、帕金森病、阿爾茲海默病等有關，提示EOST可能對上述部分疾病有一定治療作用，可為EOST的臨床應用拓展提供參考。

Fig 3 KEGG pathway analysis of EOST

Tab 2 List of GO enrichment results

Tab 3 Related diseases analyzed by DAVID database

2.5 成分-抗炎靶標分子對接EOST主要成分與8個重要炎癥靶點分子對接結果見表4，得分越高表示其分子與受體結合更好。從各成分總分來看，8,9-去氫百里香酚、苯甲醛、石竹烯、葎草烯、D-吉瑪烯、胡薄荷酮的得分較高，在炎癥作用中可能發揮重要作用，為抗炎的主要成分。從各靶點總分來看，CHRNA7、PTGS2和PTGS1是這些成分共同發揮功效的重要靶點，對IL-6、TNF、IL-1β、IL-10、CHRM1結合分數均較高。另外，薄荷酮、1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-醇乙酸酯在對接中分數均較低，表明其與炎癥相關靶點結合較低，可能抗炎作用較弱。

3 討論

前期實驗研究發現，EOST的抗炎作用機制具有多靶點-多途徑特點，作用于AA代謝、TLR信號轉導及氧化反應，此結果與Fig 3所得結果有一定對應，即與NF-κB通路相關，與PTGS2、PTGS1、IL-1β、IL-6、TNF靶點關系密切。EOST抑制AA代謝產物，減少致炎細胞因子的釋放及抗氧化作用：降低氣囊滑膜炎大鼠氣囊灌洗液及胸膜炎大鼠胸腔滲出液中PLA2和TNF的活性，降低 MDA、PGE水平，抑制致炎細胞因子 IL-1、TNF-α的生成[4]；降低胸膜炎大鼠胸腔白細胞中5-HETE、LTB4的水平，降低5-LO 活性[5]；降低哮喘小鼠肺組織中 PGE2、LTB4 水平及 MDA、NO 含量。本研究發現，EOST各成分作用于環氧酶途徑中的PTGS2(又稱COX2)和PTGS1(又稱COX1)，證實其作用于上述兩個靶點抑制AA途徑以達到抗炎效果的研究結果。另一方面，EOST抑制TLR信號轉導：下調急性肺損傷大鼠的TLR2、TLR4 mRNA表達，降低肺組織MyD88、TRAF-6、IRAK-1、IKK-α、IκB-α表達水平，降低NF-κB p65磷酸化水平[6]；降低肺炎小鼠肺組織TRAF-6、IRAK-1、IKK-α、IκB-α表達水平，并抑制IL-1β、TNF-α的生成[7]。在KEGG通路分析中表明，EOST調節NF-κB通路，影響炎癥因子IL-6、TNF、IL-1β的調節，證實其抑制TLR信號轉導通路發揮抗炎作用的研究結果。IL-17通路可通過激活NF-κB和MAPK誘導下游基因[8]，TRAF-6、IL-1β、IL-6、PTGS2、TNF為IL-17通路的重要媒介，上述研究中EOST可降低其表達，提示EOST對IL-17通路的影響，亦為實驗研究提供參考。

Tab 4 Docking results of main constituents with target protein

此外，EOST抗炎機制與NLRP3相關：EOST和胡薄荷酮能明顯抑制THP-1細胞上清中IL-1β的高分泌，下調ATP或Nigericin誘導的THP-1細胞NLRP3、caspase-1、IL-1α、IL-1β、IL-6 mRNA表達[1]。體內實驗同樣表明，EOST明顯降低LPS中毒小鼠血清 IL-1β、IL-5、TNF-α、MCP-1、MIP-1β、M-CSF、IFN-γ、IL-18、GM-CSF 水平，胡薄荷酮能明顯降低血清 IL-18、IL-1β、IL-5、MIP-1β、M-CSF 水平。兩者明顯減少模型小鼠肺組織嗜中性粒細胞數目、肺急性炎性細胞浸潤、肺組織中NO水平，下調肺組織NLRP3、iNOS、p65、IL-1β、STAT1 mRNA表達。EOST亦能抑制IFN-β、IFN-α mRNA表達，下調肺組織Cathepsin B、p20蛋白表達，提高COP1蛋白表達水平，抑制 P2X7R、NLRP3 蛋白表達，胡薄荷酮能抑制 pro-IL-1β蛋白表達，因此，EOST和胡薄荷酮的抗炎作用與抑制NLRP3炎癥小體的激活有關[9-10]。胡薄荷酮作為EOST含量高且有明顯抗炎作用的成分，是EOST物質基礎研究的重點，其在靶點預測和分子對接中表現出對TNF、IL-6、IL-1β、IL-10、PTGS2、PTGS1、CHRM1、CHRNA7等炎癥靶點有一定作用，與已有的實驗研究中對TNF、IL-6、IL-1β的作用吻合；胡薄荷酮降低急性肺損傷大鼠肺組織中NF-κB和MyD88表達[11]，證實其抑制NF-κB通路的作用。此外，其對AA通路的PTGS2、PTGS1及膽堿能抗炎通路CHRM1、CHRNA7等的作用尚未見報道，為其機制研究提供了方向。

在分子對接中，本研究發現，8,9-去氫百里香酚、苯甲醛、石竹烯、葎草烯、D-吉瑪烯、胡薄荷酮獲得很好的對接得分，結合文獻報道[12]，胡薄荷酮的抗炎作用已得到證實；石竹烯改善關節炎大鼠的全身炎癥和氧化狀態，通過AA和組胺途徑抑制細胞因子釋放[13]；葎草烯通過減少炎癥介質、黏附分子表達和轉錄因子激活來介導抗炎作用[14]。但8,9-去氫百里香酚、苯甲醛、D-吉瑪烯雖在分子對接中獲得很好的得分，但并無報道其抗炎效果，因此，這些重要成分的抗炎作用有待下一步實驗研究以證實。而含量最高的薄荷酮，無論是數據庫預測，還是分子對接中均未表現明顯的抗炎作用，少量文獻報道其具有抗炎作用，即抑制LPS誘導的促炎細胞因子IL-1β和TNF-α釋放，以及NF-κB的核移位、IκB和βTrCP[15]，因此，對于高含量成分的抗炎作用仍需進一步研究驗證。

值得注意的是，對于上述主要成分對應的重要靶點CHRNA7，即α7煙堿型乙酰膽堿受體，是膽堿能抗炎通路的重要環節，與炎癥、精神類疾病、阿爾茲海默病等有重要聯系。由此，推測EOST可能作用于膽堿能抗炎通路發揮抗炎作用，這與揮發油易透過血腦屏障的特點密切相關，可為EOST抗炎機制研究和臨床應用提供方向。

綜上，本研究通過網絡藥理學研究EOST 17個主要成分的作用機制，建立了成分-靶點網絡，PTGS2、PTGS1、CHRM1、CHRM2、CHRM3、GABRA1、GABRA2、GABRA6、SLC6A2、ADRA1B、ADRA2A、NCOA2等為主要靶點，受EOST的調節。PPI分析發現IL-6、TNF、IL-1β、SLC6A4、PTGS2、ADRB2、ADRA1B、CHRM2、CHRM1等均顯示出突出作用，其中IL-6、TNF、IL-1β、IL-10、PTGS2、PTGS1、CHRNA7、CHRM1可能是EOST發揮抗炎作用的重要靶點。對應得到的酒精濫用、2型糖尿病、精神疾病、炎癥性腸病、小細胞肺癌、利什曼病、百日咳等疾病，一定程度上擴大荊芥臨床常應用于感冒、頭痛、麻疹、風疹、瘡瘍初起等病癥范圍，為EOST的臨床應用拓展提供參考。