超聲成像在早期干燥綜合征小鼠模型中的評價作用

周偉杰，周正煒，陶 娟，邰 宇，汪丹丹，王 珍，郭派派，汪慶童，魏 偉

(安徽醫科大學臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，安徽抗炎免疫藥物協同創新中心，安徽 合肥 230032)

干燥綜合征 (Sj?gren’s syndrome，SS) 是一種慢性炎癥性自身免疫病，臨床表現為口干、眼干等癥狀，其主要侵犯外分泌腺體(如唾液腺)，同時使皮膚等其他器官受到一定程度的損害。腺體中可出現大量淋巴細胞浸潤，并累及多系統病變(如神經系統組織受損；累及關節，引起關節腫痛等)[1- 2]。動物模型是研究SS病理機制和藥物治療療效觀察的重要方法，采用何種簡單高效的技術或敏感的評價指標對SS模型進行動態觀察與評價至關重要，尤其是活體觀察SS模型動物病程變化及唾液腺腺體炎癥的產生和發展過程。唾液腺病理改變，雖然可以反映SS病變的發生，但是實驗動物必須處死才能獲取樣本病理進行觀察，導致實驗無法連續進行，且不能對SS模型動物的病程進行實時動態觀察，此外小動物的腺體組織較小，活檢技術難度較大。CT檢查輻射較大，長周期的實驗過程，對實驗操作者和實驗動物均有一定損害。血液生化指標個體間差異較大，且不夠敏感。因此，探索小動物(如小鼠)腺體病程變化的無創、動態和靈敏的檢查方法是目前SS實驗研究中面臨的重要問題之一。近年來，隨著小動物超聲成像系統的發展，其在多種疾病模型中評價及應用價值逐漸得到認可。并且超聲檢查具有無創性、無輻射、實時動態監測等優點，逐漸成為SS的一項重要臨床診斷技術，已逐步應用SS患者的診斷與療效觀察，但基礎研究中對此技術的應用和超聲觀察指標的定量分析方法尚不成熟[3-4]。本實驗以C57BL/6雌性小鼠建立SS模型，采用小動物超聲成像實時觀察SS小鼠頜下腺的大小和血流量改變，與傳統指標進行相關性分析，為超聲診斷在SS評價中的應用，以及分析方法的建立提供實驗依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康♀近交系C57BL/6小鼠，20只，SPF級，體質量20 g左右，周齡8周，購買于常州卡文斯實驗動物有限公司(合格證號：SCXK(蘇)2016-0010)，飼養于安徽醫科大學實驗動物中心。本研究中的相關操作均根據動物實驗相關指南進行，并經由安徽醫科大學實驗動物中心動物研究倫理委員會批準。

1.1.2儀器與試劑 毛果蕓香堿(批號：LRAA3042)和不完全弗氏佐劑(批號：SLBX2135)均購自Sigma公司；卡介苗(Bacille CalmettE-Guerin, BCG)購于新華區群碩實驗用品銷售部(批號：20181209DG)；異氟烷為瑞沃德生命科技有限公司產品(批號：217181101)；TM-100型醫用超聲耦合劑購自天津市西苑寺制作所(批號：20180502)；BCA蛋白定量試劑盒購于Thermo Fisher Scientific公司(批號：PF205489)；VisualSonics Vevo 2100高分辨小動物超聲成像系統為FUJIFILM公司產品；AS-01型小動物氣體麻醉機為英國Norvap公司產品。

1.2 方法

1.2.1干燥綜合征模型的建立 在無菌超凈臺上取C57BL/6小鼠頜下腺，冰上用預冷的PBS研磨20 min，3000 rmp離心15 min取上清，BCA法進行蛋白定量，調整蛋白濃度為5 g·L-1。再將 80 ℃滅活1 h的BCG溶于液體石蠟中，研磨2～3 h，終濃度為4 g·L-1BCG的完全弗氏佐劑。蛋白中加入等體積完全弗式佐劑冰上混合研磨，使頜下腺提取蛋白終濃度為2.5 g·L-1，除正常對照組外，d 0和7，各組小鼠背部酒精消毒后背部皮內多點注射抗原，每只小鼠共注射0.1 mL抗原。d 14，用不完全弗氏佐劑將頜下腺抗原濃度調整為2.5 g·L-1，注射抗原方法同前[5-6]。

1.2.2全身情況及唾液量與飲水量觀察 每天觀察全身情況，小鼠全身皮膚有無搔抓、破損現象，口唇情況等；d 0、21、28和35分別測量小鼠的唾液量與飲水量，采用小動物麻醉機對小鼠進行麻醉后，注射0.025 g·L-1毛果蕓香堿溶液(1.2 mg·kg-1)，5 min后開始收集唾液，共收集10 min唾液量(將事先稱好的無菌小棉球塞入小鼠舌下，10 min后取出稱重)[7]；小鼠飲水量以3 d為單位進行檢測，分別在d 0、21、28和35檢測。

1.2.3頜下腺指數和病理學檢查 d 35處死小鼠，取出頜下腺稱重，計算頜下腺指數(腺體質量與小鼠體質量的比值)。另外取頜下腺用10%福爾馬林固定，HE染色，光鏡下觀察，根據Cutler的方法進行病理組織學評估：0級：散在淋巴細胞浸潤；1級：少量淋巴細胞浸潤；2級：中度淋巴細胞浸潤(無淋巴灶形成)，輕度頜下腺血管及腺導管水腫；3級：每5個低倍鏡下有1個淋巴細胞灶(浸潤淋巴細胞>50 個相當于1個淋巴灶)，中度血管及腺管水腫、擴張；4 級：每5 個低倍鏡下有 2～3個淋巴細胞浸潤灶，腺泡萎縮，重度血管及腺管水腫等損傷。1 級相當于1分，2分以上為發病[8]。

1.2.4小動物超聲掃描檢查 SS小鼠造模前后d 0、21、28和35對小鼠頜下腺進行超聲檢查，采用異氟烷對小鼠進行吸入性麻醉，并對超聲掃描部位進行脫毛處理。將小鼠采用仰臥位固定于檢查板上，并涂抹一定量的耦合劑于小鼠頜下腺部位待超聲掃描。采用MS550探頭對小鼠頜下腺進行超聲檢查，并選擇General imaging模式，在B-Mode模塊下對小鼠頜下腺部位進行縱切掃查(Fig 1)。此模式下成像的小動物解剖結構，以黑/灰/白的色階顯示(黑色：表示無回聲，通常為低密度組織，如壞死組織、血管和積液；灰色：表示低回聲，通常為中密度組織，如脾、膽、肝等器官；白色：表示強回聲，通常為高密度組織，如氣泡和結石等)，圈出腺體長軸縱切面積。采用Color Doppler-mode又稱為彩超模式，觀察小鼠頜下腺腺體內是否有血流信號及豐富程度。整個超聲掃查過程，保持探頭對準小鼠頜下腺部位且壓力適中，并控制超聲探頭位置與腺體的間距，防止腺體受壓變形，以免影響觀察實驗結果。采集圖像，對Color Doppler檢測結果進行半定量評分，0分，腺體內部偶見少量斑狀血流信號(0～1個血流斑點)；1分，腺體內部有少量血流信號(2～3個血流斑點)；2分，腺體內有較多的血流信號(4～5個血流斑點)；3分，腺體內部血流信號較豐富(6個及以上血流斑點)；左右側腺體評分不一致時，以高分側評分為最終分數。

Fig 1 Ultrasonic probe positioning: axial incident

2 結果

2.1 SS小鼠造模后d 28左右檢測出飲水量和唾液量的明顯改變如Fig 2所示，采用自身抗原誘導小鼠SS模型，分別在d 0、21、28和35檢測小鼠相對唾液量和相對飲水量，模型組小鼠的相對唾液量在d 28和35均較正常組顯著降低(P<0.01)(Fig 2A)，而相對飲水量較正常組明顯升高(P<0.01)(Fig 2B)，從d 0開始每周稱量小鼠的體重，模型組較正常組在d 28和35體重有所減輕，但未見統計學差異(Fig 2C)。d 35處死小鼠，取頜下腺稱重，計算頜下腺指數，模型組較正常組頜下腺指數升高，且具有統計學意義(P<0.05)(Fig 2D)。d 35處死小鼠，取出頜下腺進行HE染色，正置顯微鏡下觀察，如Fig 3所示，模型組小鼠與正常組小鼠相比，頜下腺內有大量淋巴細胞浸潤，并形成淋巴細胞浸潤灶，并伴有嚴重的血管及腺管水腫和擴張，病理分析具有統計學差異，提示模型建立成功。

2.2 超聲檢測造模后d 21即可觀察到SS小鼠的腺體腫大如Fig 4所示，在B-Mode模塊下采用小動物超聲成像系統檢測不同時期小鼠頜下腺的影像，模型小鼠與正常小鼠相比，d 21即出現頜下腺超聲軸面Area值明顯增高，且具有統計學差異(P<0.01)，但模型小鼠和正常小鼠的頜下腺超聲回聲強度均未見明顯改變；如Fig 5所示，在Color Doppler-mode模塊下檢測不同時期小鼠頜下腺的超聲影像，模型小鼠與正常小鼠相比，d 28開始頜下腺超聲血流信號明顯增高，且具有統計學差異(P<0.01)。

2.3 干燥綜合征模型頜下腺超聲影像學改變與常規診斷指標具有顯著相關性如Fig 6 A和B所示，對常規SS診斷指標飲水量和唾液量與頜下腺超聲軸面Area值進行相關性分析，飲水量與超聲頜下腺軸面Area值具有顯著正相關(r=0.74，P<0.01)，唾液量與超聲頜下腺軸面Area值存在顯著負相關(r=-0.77，P<0.01)。如Fig 6 C和D所示，飲水量與頜下腺Color Doppler評分(血流信號等級)具有顯著正相關(r=0.89，P<0.01)，唾液量與Color Doppler評分(血流信號等級)存在顯著負相關(r=-0.86，P<0.01)。病理檢查顯示的腺體血管擴張程度評分與超聲Color Doppler評分(血流信號等級)具有顯著正相關(r=0.78，P<0.01)，腺體導管水腫程度評分與超聲軸面Area值具有顯著正相關(r=-0.83，P<0.01)(Fig 6 E和F)。

Fig 2 Detection of routine indicators in mice at different periods

Fig 3 Pathology of submandibular gland n=5)

3 討論

SS是一種累及外分泌腺體和淋巴細胞浸潤的全身性異常炎癥免疫反應為特征的疾病，其局部臨床表現為口干、眼干和牙齒脫落[9]。動物模型是研究SS病理機制和療效觀察的重要前提，但目前評價動物模型方法和技術的缺乏很大程度限制了對該疾病的研究進展。因小動物超聲檢查具有無創傷、無輻射和實時動態檢測等優點，所以逐漸成為多種疾病動物模型評價的標準。在臨床上，干燥綜合征患者早期的唾液腺腺體淋巴細胞浸潤，腺體導管和血管擴張水腫，超聲表現為腺體形態增大或正常，晚期腺體細胞被纖維組織取代，腺體實質回聲不均勻，最終表現為腺體纖維化和腺體形態萎縮[10]。而本研究通過自身免疫誘導法建立干燥綜合征模型，通過小動物超聲和傳統常規檢測指標的觀察發現，模型小鼠癥狀與臨床干燥綜合征早期病人癥狀相似，表現為模型小鼠血管和腺體導管擴張，淋巴細胞浸潤，腺體腫脹。臨床上超聲診斷原發性SS的靈敏度、特異度、準確率、陽性預測值以及患者的依從性均較傳統檢測方法有所提高[11-12]。超聲成像系統是否可以應用到SS動物模型的基礎研究，準確性和靈敏度如何，以及檢測結果應該怎樣統計分析目前尚無相關報道。

Fig 4 Ultrasonic axial area of submandibular gland

傳統的SS動物模型評價手段包括飲水量和唾液量的測量，病理切片的觀察等，存在多種不足之處，如飲水量的檢測存在較大的個體差異以及多種外界環境因素的干擾而無法準確測量。唾液量的檢測需要先對小鼠進行麻醉，再腹腔注射一定劑量的毛果蕓香堿，會引起胃腸道平滑肌收縮[13]，可能會影響研究者后續的體內實驗結果，過量的藥物劑量還會引起小鼠全身性中毒、支氣管痙攣和嘔吐等不良反應，嚴重者還會導致小鼠死亡，樣本減少。而病理切片的觀察需要處死小鼠取頜下腺，不僅耗費模型小鼠的樣本量，還無法針對模型小鼠腺體進行病程連續性觀察或者給藥前后的療效自身比較。本研究發現，頜下腺超聲在發病初期即可觀察到腺體的輕度腫大，在出現明顯的臨床表現即唾液量降低和飲水量升高之前，診斷更為靈敏，與臨床治療和病理改變具有顯著相關性。

Fig 5 Ultrasonic blood flow signal grade of submandibular gland in different periods n=6)

綜上所述，采用小動物超聲成像可以為SS實驗動物模型提供非侵入式且連續性的結構及功能的觀察。超聲干預的小鼠可以前后自身做對照，數據更加可信，且重復性高，能夠減少對樣本動物的創傷和死亡率。并且其高分辨率的影像可以給研究者提供更清晰的結果，例如裸鼠前列腺原位模型體積小, 超聲檢測能夠在不損傷臟器前提下準確獲得深部瘤體體積[14]。但是超聲檢查也有其局限性：操作的規范依賴于操作者的技術水平，且易受到操作者主觀意識的影響，因此要對操作者進行深度培訓，并且由檢測者以外的實驗人員進行客觀的分析統計。總之，本研究使用小動物超聲系統分析SS動物模型腺體病變，希望為評價SS動物模型及其他組織疾病模型提供一個新的視角和檢測方法，從而更好推動疾病模型的基礎研究。

Fig 6 Correlation analysis between conventional detection indexes and ultrasonic indexes (n=20)