線粒體通透性轉換孔在神經退行性疾病中的作用研究進展

蔡 瑩，孔凡叢，丁慶慶綜述，楊 燕,2審校

線粒體是細胞中制造能量的結構，通過三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的形式提供能量，調節細胞內鈣穩態和維持細胞內的氧化還原應激，從而在細胞存活中發揮重要作用[1]。在中樞神經系統(central nervous system，CNS)中，線粒體調節細胞存活和各種凋亡途徑，對神經元的存活和死亡至關重要。線粒體結構為桿狀(0.75～3 mm)，為真核細胞中雙層膜包被的細胞器，其外膜和內膜包含磷脂和蛋白質。與線粒體外膜(outer membrane of mitochondria，OUM)相比，線粒體內膜(inner membrane of mitochondria,IMM)更復雜，折疊強度更大，大分子相對不易滲透。線粒體外膜(OUM)光滑，能滲透大量的營養物質、離子和能量分子(ATP和ADP)。IMM的不透水特性對于維持線粒體內環境的穩態以及線粒體的完整性至關重要。IMM中的不同離子通道和轉運蛋白有助于線粒體與外部環境之間的通信。例如，鈣(Ca2+)通過能量驅動的單向轉運體從細胞質進入線粒體，而Ca2+從線粒體向細胞質的流出是由離子梯度驅動的反向轉運體調節。氧化應激增加和能量代謝受損會損害Ca2+穩態，導致鈣超載和錯誤轉運。這種異常情況導致鈣通過非選擇性通道快速流出，最終導致mPTP的形成[2]。

1 mPTP的結構與功能

線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)由Hunter等人發現，是存在于線粒體內外膜之間的一組蛋白復合體，是一種峰電導為～1.3 nS 的非選擇性通道。通透性轉換(permeability transition,PT)是指線粒體內膜(IMM)對分子量高達1.5 kDa的離子和溶質的通透性增加，導致線粒體基質腫脹，細胞通過凋亡(程序性細胞死亡)和壞死(非程序性自溶)而死亡[3]。直到最近，mPTP的結構仍存在爭議，目前認為mPTP包括OMM中的電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)、IMM中的腺嘌呤核苷酸轉運子(adenine nucleotide translocator,ANT)和線粒體基質中的親環素D(cyclophilin D,CypD)[4]。VDAC有助于線粒體外膜的通透性并與線粒體的苯二氮卓受體相關，因此它們調節線粒體外膽固醇向膜間隙的轉移。ANT允許腺嘌呤核苷酸的磷酸化和非磷酸化衍生物通過IMM流入，CypD是線粒體通透性轉換孔的關鍵組成部分，因具有肽丙異構酶活性而有助于蛋白質折疊，CypD也與神經退行性疾病相關[2]。

在正常生理條件下，mPTP的所有成分都被解聚；而在凋亡或應激刺激下這些成分會結合形成1.0～1.3 nm的孔隙，觸發分子的非選擇性通量。鑒于mPTP形成的機制基礎，研究人員提出mPTP的形成是由IMM中的ANT與CypD的結合引發的，其中CypD從線粒體基質轉移至IMM。這種結合促進了由ANT和VDAC組成的隧道樣結構的形成，并通過跨越兩個線粒體膜將線粒體基質與胞質連接起來。 mPTP的形成不僅是細胞死亡的關鍵事件，還對線粒體的功能和細胞發育非常重要[5,6]。使用鈣超載模型，發現mPTP開放需要組裝ATP酶(C-亞基)、無機多磷酸鹽(polyP)和聚羥基丁酸酯(PHB)[7]。

除了以上成分，F1F0-ATP合成酶是mPTP孔型結構的組成成分，也參與mPTP開放。Bonora等使用遺傳方法表明F1F0 ATP合成酶二聚體的解離和C環的參與在mPTP誘導中至關重要[8]。Baev等利用光散射，熒光和電子顯微鏡技術，發現鈣誘導的PTP在低滲溶液中被顯著抑制[9]。使用基于RNAi的篩選方法，Shanmughapriya等證實了痙攣性截癱7(spastic paraplegia 7，SPG7)在Ca2+和ROS誘導的PTP開放中的必要性作用,并提出SPG7是構成PTP復合體并調節其功能的保守核心組成部分[10]。關于VDAC和ANT參與mPTP形成的研究報道尚存在差異，這提示還存在可促進mPTP形成的其他重要分子成分，但CypD被認為在mPTP的組成中至關重要。 mPTP開放與各種神經退行性疾病有關，包括阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)、朊病毒病 (prion disease)、運動神經元病(motor neuron disease,MND)，亨廷頓舞蹈癥(Huntington disease,HD)、脊髓性肌萎縮癥(Spinal muscular atrophy,SMA)和肌萎縮側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)[1]。mPTP開放的特征在于整個IMM的電化學勢能的解耦聯和線粒體滲透性的紊亂，伴隨著Ca2+的錯誤轉運和線粒體中ATP生成減少。當mPTP開放時，通過凋亡途徑發生細胞死亡，這會導致氧化磷酸化和ATP水解的機制減少。在此過程中，充足的ATP和mPTP的瞬時開放導致細胞色素C通過線粒體釋放，其激活半胱天冬酶級聯反應和線粒體驅動的細胞凋亡。與細胞凋亡相反，持續和廣泛的mPTP開放通過介導氧化磷酸化的解偶聯來限制ATP合成。隨著高能量需求的開始和ATP產生的減少，細胞團失去其結構和功能完整性，導致不可逆的損傷和細胞死亡[11]。

2 mPTP在不同神經退行性疾病中的作用

2.1 AD和mPTP 阿爾茨海默病(AD)是一種神經退行性疾病，其特征在于認知功能逐漸下降和神經元不可逆轉的喪失。AD是老年期最常見的癡呆類型，是隨后導致死亡的主要原因。AD腦的病理特征在于β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成的神經炎性斑和tau蛋白過度磷酸化形成的神經原纖維纏結(NFTs)。神經炎性斑和神經原纖維病變均可導致受累腦區神經元的丟失[12]。mPTP的開放可能與在AD腦中觀察到的線粒體功能障礙有關，mPTP在AD的代謝應激中起作用。Bonora M等發現來自AD患者和AD動物模型的腦線粒體中CypD表達增加[13]。在淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)過表達的轉基因AD小鼠模型中，CypD蛋白的基因去除可防止線粒體功能障礙，并改善突觸和認知功能喪失，而且從CyPD基因敲除小鼠中獲得的神經元顯示出Aβ依賴性活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產生減少，鈣緩沖能力增加，線粒體呼吸功能改善以及AD中突觸可塑性異常的減弱[1]。在對AD患者外周組織線粒體功能障礙的研究中，Maria Jose Perez等研究發現AD患者皮膚成纖維細胞表現出與AD病理影響的神經元相似的線粒體損傷跡象，AD成纖維細胞有線粒體鈣調節障礙，并顯示出非特異性線粒體鈣通道的持續激活，即mPTP。使用環孢素A (Ciclosporin A,CsA)藥物阻斷mPTP的作用可以阻止AD成纖維細胞線粒體超氧化物水平的增加，改善AD成纖維細胞線粒體和胞質鈣的失調[14]。

神經毒性聚集體的沉積是由毒性肽的過量產生和清除機制的功能障礙介導的。這些聚集體會誘發神經元的功能障礙，導致認知和記憶障礙，而且自由基生成和鈣平衡失調會增加聚集體的神經毒性作用。Aβ的存在已在人AD腦和轉基因(Tg)AD動物模型的線粒體中得到證實[15]。關于線粒體中的Aβ是原位產生還是輸入的尚有爭議，Picone P等提出Aβ來源于細胞外和細胞內池，然后在線粒體中內化[16]。Aβ和CypD之間的相互作用導致mPTP的形成，線粒體電位降低、線粒體呼吸功能降低、自由基形成增加、導致氧化應激和促凋亡蛋白的釋放。鑒于AD的病理生理級聯反應起始于mPTP形成，針對mPTP的治療性干預可能有助于逆轉該疾病病理。目前，mPTP已作為神經退行性疾病的潛在藥物靶點廣泛研究。

2.2 PD和mPTP 帕金森病(PD)目前影響全球約630萬人，預計到2030年將影響800萬～900萬人。它主要通過黑質致密部(substantia nigra pars compacta,SNPc)中多巴胺能神經元的喪失和突觸前神經元細胞中過量α-突觸核蛋白的存在來影響運動神經元，該疾病的主要臨床表現有靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢平衡障礙。細胞氧化還原狀態受損、代謝缺陷和線粒體功能障礙在PD中有報道，Ca2+穩態、α-突觸核蛋白聚集體的喪失、線粒體呼吸復合物I缺陷和線粒體自噬也與PD有關[17]。與AD相似，PD通過線粒體功能障礙以相同的方式形成mPTP，包括一系列事件：IMM去極化、受損的氧化磷酸化、ROS產生增加、線粒體基質腫脹、IMM嵴去折疊、Ca2+穩態喪失、以及通過OMM釋放凋亡蛋白，最終導致細胞死亡。Ludtmann MHR等研究發現LRRK2的缺失、抑制和突變能導致通過Na+/Ca2+/ Li+交換體(NCLX)進行的的線粒體Ca2+排出受損，進而降低線粒體通透性轉換孔(PTP)的開放閾值并增加細胞死亡。NCLX活性可以通過直接(擬磷酸NCLX突變體)和間接(蛋白激酶A)激活來恢復，反過來提高了PTP開放閾值。這可能為PD的治療提供一種新的策略[18]。

2.3 HD和mPTP 亨廷頓舞蹈病(Huntington disease,HD)是一種遺傳性常染色體顯性遺傳病，神經元代謝和能量處理的缺陷是HD腦的主要特征。其臨床表現為進行性運動功能障礙和精神障礙，并伴有癡呆。HD是由于亨廷頓基因(Htt)CAG重復序列的異常擴增導致亨廷頓蛋白質(mHtt)中聚谷氨酰胺的病理延長，進一步損害腦細胞所致。目前Htt在細胞中以及病理機制中的作用尚不明確。越來越多的證據表明線粒體損傷參與了該病的發病機制和進展。 在細胞和鼠類HD模型中，多個研究發現了線粒體紊亂，包括鈣處理缺陷、去極化、線粒體運輸能力下降、ATP產生減少以及活性氧(ROS)增多。系統分析表明，線粒體通透性轉換孔(mPTP)可能是影響線粒體的這些變化的原因。阻斷mPTP活性不僅可以預防整體的線粒體缺陷，還可以逆轉Htt引起的腦病變。因此，進一步了解Htt是否通過mPTP直接或間接影響線粒體功能，對于確定HD的病理進展和發現新的治療靶點具有重要意義[1,19]。

3 mPTP是一種潛在的藥物靶點

不可逆的mPTP形成與各種神經退行性疾病有關，制定藥理學和遺傳學干預措施抑制mPTP的形成為治療神經退行性疾病提供了方向。

目前認為，在所有參與mPTP形成的組分中，CypD發揮關鍵作用。在阿爾茨海默病(AD)中，線粒體功能障礙是誘發突觸損傷和神經應激的關鍵。AD患者的線粒體表現出呼吸功能、能量代謝和線粒體形態的改變[20,21]。與非AD腦的線粒體相比，從AD患者大腦皮質和海馬區分離的線粒體中CypD的表達顯著增加。Du H等研究發現CypD表達增加與Aβ表達增加呈正相關，二者具有結合親和力，而且具有序列特異性。表達APP突變的AD小鼠模型與其同窩對照組相比，也表現出大腦皮質和海馬區CypD表達增加[15]。有研究使用mAPP模型建立mPTP形成過程中發生的各種事件，包括使皮質線粒體中IMM的CypD表達增加、Ca2+穩態改變和線粒體腫脹，并進行了消融CypD以防止mPTP形成的研究[2]，使用CypD抑制劑環孢菌素A消除CypD也可以減輕這些不利影響[14]。

線粒體F1Fo ATP合酶失調是一種典型的線粒體缺陷，導致該疾病中氧化磷酸化的失敗。寡霉素敏感性相關蛋白(Oligomycin sensitivity conferring protein,OSCP)是至關重要的F1Fo ATP合酶亞基。OSCP水平降低以及OSCP與β淀粉樣蛋白(Aβ)的相互作用構成了AD相關疾病中F1Fo ATP合酶病理的關鍵方面。目前促進這種與AD相關的OSCP變化的詳細機制尚未闡明。Gauba E等在AD患者以及AD小鼠模型中發現，CypD可能是AD相關疾病中介導OSCP缺陷的關鍵媒介，AD小鼠模型中CypD缺失可以使OSCP的改變減少，F1Fo ATP合酶功能得以保留，線粒體生物能量學得以恢復以及小鼠的認知能力得到改善。AD治療中線粒體功能障礙的一種治療策略[22]。Thomas B等采用神經毒素MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6 -四氫吡啶)制備的急性PD小鼠模型模型中，與對照組小鼠相比，CypD基因敲除(Ppif-/-)組顯示出明顯的細胞保護作用[23]。在急性大腦中動脈閉塞和再灌注后，CypD缺陷小鼠的腦梗死面積也顯著減少，有力地支持了CypD在鈣超載和氧化應激受到影響的缺血性損傷模型中具有重要作用。同樣，在體外研究中，CypD在線粒體通透性轉換(CyD-mPT)中的重要作用在谷氨酸引發的延遲鈣失調(delayed calcium deregulation,DCD)和興奮毒性細胞死亡中得到驗證。與對照小鼠相比，來自Ppif-/-小鼠的皮質神經元對DCD和細胞死亡更耐受。

以上研究均表明CypD是預防慢性神經退行性疾病進展的強有力的作用靶點。為了確定mPTP形成在神經退行性疾病進展中的作用，臨床研究主要使用CypD抑制劑環孢菌素。但是環孢菌素作為研究CypD抑制和線粒體功能障礙的臨床工具具有一定的局限性，主要包括其毒性和免疫抑制作用，其他方面包括組織穿透力和血腦屏障的穿透力低等[1]。Warne J等設計并合成了一種新的線粒體靶向CypD抑制劑JW47，其使用喹諾鹽陽離子與環孢霉素結合。在實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠模型中發現，JW47表現出對軸突的顯著保護作用，并通過最少的免疫抑制改善了運動評估[24]。Ahmed-Belkacem等人利用基于核磁共振(NMR)和X射線晶體學等方法生成了一種新的非肽類小分子親環素抑制劑家族，與CsA無關，具有很強的體外PPIase抑制活性[25]。Elkamhawy A等測定了28種新型吡嗪基脲對β淀粉樣蛋白(Aβ)誘導的mPTP開放的對抗作用，其中17種化合物對Aβ誘導的mPTP開放的神經保護作用優于CsA。其中1-[3-(芐氧基)(吡嗪-2-基)-3-(3,4-二氯苯基)脲(5)]、1-[3-(benzyloxy)(pyrazin-2-yl)-3-(3,4- dichlorophenyl)urea (5)]在ATP測定和MTT測定中有效地維持了線粒體功能和細胞活力[26]。

今后，多種藥理學方法的使用將通過增加候選分子的藥物樣特性和生物活性來促進新藥物的開發，例如增強線粒體生物發生、抑制過量的線粒體ROS產生和mPTP開放。候選藥物分子可以通過最佳擬合合成，半合成和微生物分子的虛擬篩選及其化學轉化得到新型活性類似物，并使用計算機模擬定量結構活性關系(quantitative structure-activity relationships,QSAR)建模、分子對接、吸收、分布、代謝、排泄和毒性研究，以設計出具有更高生物利用度、更低毒性、穿過血腦屏障及其他特性的藥物。

4 小 結

綜上所述，線粒體功能障礙和mPTP形成在介導神經退行性疾病中具有重要作用。盡管與神經退行性疾病相關的mPTP形成的結構和機制基礎尚未明確闡明，但用mPTP抑制劑獲得的結果表明其作為治療各種神經退行性疾病的潛在靶點具有良好前景。利用QSAR建模等優化技術進行藥物開發也有助于篩選虛擬模擬物及其藥物樣潛能。