核因子E2相關因子2在糖尿病腎病中的研究進展

沈 倩，王 利，趙 鼎SHEN Qian,WANG Li,ZHAO Ding

(1.鹽城師范學院藥學院，江蘇 鹽城 224002；2.上海中醫藥大學附屬普陀醫院腎內科，上海 200062；3.南京中醫藥大學附屬鹽城市中醫院，江蘇 鹽城 224000)

糖尿病是世界性公共衛生問題，據國際糖尿病聯盟發布的2017年統計數據顯示，全球有4.25億糖尿病患者，預計到2045年將達到7億。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的重要慢性微血管并發癥，臨床表現為蛋白尿、腎小球濾過率下降及腎功能減退等[1]。隨著糖尿病發病率的升高，糖尿病腎病的患病率也呈逐年上升趨勢，且成為終末期腎病的主要原因，嚴重影響患者的生活質量并增加社會的醫療負擔。

目前DN的治療方法主要包括控制血糖、血壓、血脂水平，腎素-血管緊張素抑制劑的使用及生活方式的改變等，但療效卻不甚滿意，因此尋求新的有效治療方法對防治DN顯得迫在眉睫。然而DN的發病機制復雜，對其研究仍在不斷進展中，氧化應激作為重要的發病機制之一始終處于核心地位。轉錄因子核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)作為機體抗氧化應激過程的關鍵分子，近年來研究發現其在延緩DN進展中起著重要作用[2]，因此本文就Nrf2在糖尿病腎病中的研究作一綜述。

1 Nrf2概述

1.1 Nrf2結構

Nrf2是CNC(cap‘n’collar)家族中轉錄活性最強的轉錄因子，具有堿性亮氨酸拉鏈結構(basic leucine zipper，bZIP)，含有 7個高度保守的Nrf2-ECH(Neh)同源結構域，即Neh1～Neh7[3]。Neh1包含基本的CNC-bZIP結構，可促進Nrf2向細胞核內轉移，并與抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)結合，進而促進下游靶基因的轉錄。Neh2是一個高度保守的結構域，可參與胞漿中泛素-蛋白酶體介導的Nrf2降解，并能促使Nrf2與Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)結合，從而調控Nrf2活性。Neh3-Neh5是Nrf2的反式激活結構域，Neh3通過與染色質重構蛋白6作用來激活Nrf2，Neh4和Neh5通過與其它轉錄共激活因子結合啟動Nrf2靶基因的轉錄。Neh6可與二聚體β轉導子重復包含蛋白結合從而負調控Nrf2的轉錄活性。Neh7通過與視黃酸受體α結合，抑制Nrf2下游靶基因的表達。

1.2 Nrf2的分子調控機制

生理情況下，位于細胞質中的Keap1通過其Kelch重復結構域與Nrf2的Neh2結構域結合，將Nrf2定位于細胞質中，抑制其向細胞核內的轉移，并介導Nrf2的泛素化降解，從而抑制Nrf2的活性。當細胞內發生氧化應激時，Keap1構象發生改變，與Nrf2解離，游離的Nrf2進入細胞核，在核內不斷蓄積激活下游靶基因的轉錄，同時Keap1構象改變失去了對Nrf2的降解作用，使Nrf2處于活化狀態。因此Keap1是Nrf2的負調控蛋白。

除Keap1外，細胞中還有多種蛋白激酶和蛋白分子，在氧化應激發生時被激活，不依賴于Keap1直接與Nrf2作用，使其發生磷酸化和構象改變，進而入核發揮轉錄活性。目前研究這些蛋白激酶主要包括蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)、酪氨酸蛋白激酶(Fyn)、酪蛋白激酶2相互作用蛋白-1(Casein kinase 2 interacting protein-1，CKIP-1)、沉默信息調節因子2相關酶1(sirtuin1，SIRT1)等[4]。不同的磷酸化位點對Nrf2有不同的效應，如PKC可使Nrf2上的Ser40發生磷酸化，從而激活Nrf2入核發揮轉錄活性；Fyn可使Nrf2上的Tyr568發生磷酸化，促使Nrf2出核從而抑制Nrf2活性[5]。

此外，研究表明micro RNA(miRNA)與長鏈非編碼RNA(lncRNA)也參與Nrf2活性的調控，如在腎小管上皮細胞中，miR-29可通過抑制Keap1 mRNA表達，促進Nrf2泛素化而保護小管細胞[6]；MIAT作為lncRNA的代表，可通過維持細胞內Nrf2活化的穩定性而減少高糖誘導的腎小管上皮細胞的損傷[7]。總之，Nrf2的活性主要受Keap1和蛋白激酶的調控，miRNA和lncRNA對Nrf2的調控研究相對較少，尤其是lncRNA如何調控Nrf2，還有待進一步研究。

2 Nrf2在糖尿病腎病發病機制中的研究

DN發病機制主要與氧化應激及相關炎癥和纖維化、糖脂代謝紊亂、腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)、線粒體功能障礙、遺傳因素等有關。Nrf2作為重要的轉錄因子，通過多種途徑參與DN的發生發展。

2.1 Nrf2與氧化應激及相關炎癥和纖維化

氧化應激、炎癥及纖維化是DN的重要發病機制，三者之間有密切聯系，Nrf2作為重要的抗氧化酶，可通過多種途徑參與機體抗氧化反應。首先，Jiang等[8]在DN患者的腎組織中觀察到活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)增加及Nrf2水平升高。其次，在體內動物研究中，發現鏈脲佐菌素(STZ)誘導的1型DN小鼠，Nrf2(-/-)比Nrf2(+/+)小鼠有更高的ROS水平、DNA損害和更嚴重的腎臟病理損害；進一步發現激活SIRT1，從而激活Nrf2抗氧化通路，可減輕腎臟內氧化應激、炎癥和纖維化水平。在2型DN小鼠中，Song等[9]通過下調miR-27a，直接減少miR-27a與Nrf2的結合，促進Nrf2的活化，進而抑制db/db小鼠腎組織內氧化應激和炎癥反應。在體外研究中，發現激活Nrf2/ARE通路可減少細胞內ROS水平、抑制腫瘤壞死因子-α、白細胞介素等炎癥因子和纖維連接蛋白、IV型膠原蛋白等纖維化蛋白的表達，從而改善高糖誘導的小管細胞、系膜細胞和內皮細胞損傷[10]，進一步發現Nrf2/ARE的激活受SIRT1、CKIP-1及Fyn的調控。可見，Nrf2在DN氧化應激、炎癥及纖維化中研究廣泛，多種途徑均可通過調控Nrf2發揮作用，也說明Nrf2在DN中的重要性。

2.2 Nrf2與糖脂代謝紊亂

糖尿病狀態下腎組織中糖代謝活躍，葡萄糖可經過一系列反應形成晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)，是造成腎臟損傷的重要病理因素。實驗研究發現，糖尿病模型腎小球內有大量的脂質沉積，并與腎小球的病理損害程度相關，而特異性降脂治療能逆轉DN進展，因此糖脂代謝紊亂也是DN的重要發病機制之一。在STZ誘導的DN小鼠中發現，上調Nrf2可明顯抑制AGEs生成和AGEs受體表達，從而改善DN小鼠的糖毒性損傷。同時，Cheng等[11]發現非諾貝特(一種有效的降脂藥)改善1型和2型DN小鼠腎損傷是通過PI3K/Akt/GSK-3β/Fyn介導的Nrf2途徑的激活來實現的。在棕櫚酸酯(palmitate，PA)誘導的系膜細胞脂毒性研究中發現，激活Nrf2可抑制PA誘導的內質網應激及凋亡基因的表達，從而減輕PA誘導的系膜細胞脂毒性損傷[12]。

2.3 Nrf2與RAS

RAS是一個調節鈉平衡、體液平衡和動脈血壓的激素系統，所有的RAS成分在腎內均有表達：包括腎素、血管緊張素原(angiotensinogen，Agt)、血管緊張素1-7受體(MasR)、血管緊張素轉換酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)、血管緊張素轉換酶2(Ace2)。其中Agt主要在近端腎小管上皮細胞中表達，并經腎素轉化為非活性Agt I，再經ACE轉化為活性Agt II。在DN發病過程中，無論是早期還是晚期都有一系列血管活性物質參與，而腎內RAS的異常活躍，引起腎小球血流動力學紊亂，導致腎小球內高壓、高濾過、高灌注，進一步引起腎小球損害和蛋白尿發生，促進DN的發展。Zhao等[13]在研究Nrf2對RAS基因表達的影響中，采用高糖誘導近端腎小管損傷模型，用siRNA或Nrf2抑制劑抑制Nrf2表達后，發現Agt、ACE基因轉錄減少，而Ace2、MasR基因表達則增加。說明Nrf2刺激腎臟內RAS基因的表達，從而調控腎內RAS及血流動力學，由此推測Nrf2抑制劑有可能作為RAS抑制劑，改善腎小管纖維化和腎小管萎縮。

2.4 Nrf2與線粒體功能障礙

線粒體是一種重要的細胞器，存在于大多數真核細胞中，是細胞氧化磷酸化發生的主要場所，通過三羧酸循環合成腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)，為細胞提供能量，維持細胞的正常功能。腎臟細胞內含有豐富的線粒體，線粒體是產生ROS的主要部位，而ROS是導致腎臟損害的重要因素，因此線粒體功能障礙在DN的發病中越來越受到重視。目前在腎臟中有關Nrf2與線粒體功能的研究相對較少，主要集中在線粒體自噬方面。Sun等[14]在db/db小鼠模型和高糖誘導的腎小球內皮細胞中，發現線粒體自噬缺乏，線粒體ROS生成增加、膜電位下降以及PINK、parkin蛋白表達減少，通過促進Nrf2核轉錄，激活Nrf2/ARE途徑，可以增加PINK、parkin蛋白的表達，逆轉線粒體功能。在db/db小鼠腎小管和高糖誘導的腎小管細胞中，也發現線粒體自噬缺乏及線粒體功能障礙，使用mitoQ(一種靶向線粒體的抗氧化劑)處理后，增加了Nrf2的轉錄活性及PINK、parkin蛋白的表達，減少小管細胞的凋亡；進一步用Nrf2 siRNA干預后阻斷了mitoQ對線粒體自噬和小管損害的保護作用。說明Nrf2在線粒體自噬和線粒體功能方面起重要作用。

2.5 Nrf2與遺傳易感性

近年來，遺傳因素在DN的發病中倍受關注，臨床中發現并非所有的糖尿病患者都會發生腎臟損害，遺傳因素決定了機體對內環境紊亂有不同的反應，即在DN易感性方面有重要作用。目前對遺傳易感性研究較多的是基因多態性。近期，吉林大學第二醫院腎臟病研究組發現[15]，在中國東北地區的漢族人群中存在Nrf2 基因變異，包括rs2364723、rs10497511、rs1962142、rs6726395，并證實了其與糖尿病并發癥有關。此外，在人類糖尿病腎臟中也觀察到Nrf2信號失調。因此Nrf2 基因變異對糖尿病病人是否發展為DN可能起重要作用，但這方面的研究目前仍較欠缺，還有待進一步探索。

3 中藥及其有效成分激活Nrf2在糖尿病腎病治療中的研究

在DN的治療中，除一般性治療(控制血糖、飲食、運動及服用Agt II受體阻斷劑)外，還有很多關于Nrf2激活劑的基礎及臨床研究，如蘿卜硫素、白藜蘆醇、鋅、泛素蛋白酶體抑制劑等，其中研究最多的是甲基巴多索隆(bardoxolone methyl，BM)，并進入II期臨床試驗[16]。在試驗過程中，BM能有效地改善腎小球濾過率，但卻因嚴重的心血管事件而被迫終止。中藥及其有效成分在DN的治療研究已久，并具有可觀的應用前景。

3.1 姜黃素

姜黃素是Nrf2激活劑在DN研究中最多的中藥成分。作為姜黃根莖的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗癌、降低血脂、血糖的作用，尤其是抗氧化作用。Bo Hwan等[17]在2型DN模型大鼠中觀察到，姜黃素可以通過上調Nrf2信號通路，有效改善蛋白尿、腎小球病理改變、尿丙二醛(Malonaldehyde，MDA)及超氧化物歧化酶水平，抑制氧化應激，保護腎小球。在體外研究中發現，姜黃素可抑制腎小管上皮細胞上皮-間質轉分化，并與Nrf2蛋白的上調有關；用siRNA敲減Nrf2基因后姜黃素的抗纖維化作用減弱，說明姜黃素通過上調Nrf2發揮抗纖維化作用，從而保護小管細胞。Yang等[18]在2型DN患者中，給予姜黃素500 mg/d口服，治療15～30天，結果發現姜黃素可明顯減少尿微量白蛋白、血漿MDA水平，增加血淋巴細胞中Nrf2通路相關蛋白醌氧化還原酶(NAD(P)H quinone oxidoreductase 1，NQO-1)及其它抗氧化酶水平，并能減少血漿脂多糖含量、抑制淋巴細胞中相關炎癥蛋白的表達，從而減緩DN的進展。由此可見，姜黃素通過激活Nrf2途徑延緩DN的發展已有了一定的基礎和臨床研究，有望進一步進入臨床試驗階段，并成為治療DN的新藥。

3.2 虎杖苷

虎杖苷是中藥虎杖的主要活性成分，也稱為白藜蘆醇苷，藥理研究具有抗炎、抗氧化等多種藥理活性，臨床上已被用于預防卒中、缺血/再灌注損傷及充血性心力衰竭等，在DN的治療中也多有研究。Gong等[19]發現虎杖苷通過促進Nrf2/ARE抗氧化通路，抑制腎小球系膜細胞纖維化，進而改善DN大鼠腎功能，進一步研究發現，Nrf2的激活受CKIP-1的調控，即虎杖苷通過激活CKIP-1-Nrf2-ARE通路延緩糖尿病腎纖維化。此外虎杖苷還可通過Sirt1途徑激活Nrf2/ARE通路，減輕腎小球系膜細胞氧化應激損傷，進一步發現虎杖苷可減少AGEs受體，從而增加Sirt1蛋白的表達和活性，并促進Nrf2靶基因的轉錄，最終抑制氧化應激損傷。因此，虎杖苷可能通過多種途徑發揮抗氧化、抗炎作用，而Nrf2有可能是其作用的關鍵因子。

3.3 黃連素

黃連素是從植物黃連、黃柏中提取的生物堿，具有多種藥理活性，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗纖維化作用等。研究表明，黃連素可通過減少轉化生長因子-β表達，抑制細胞外基質沉積，改善糖尿病小鼠的腎功能，抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞增殖。而近年來有關黃連素對腎小管細胞的保護作用受到格外關注，研究表明，黃連素通過抑制內質網應激和線粒體應激，保護腎小管細胞免于缺血/再灌注損傷，并能通過多種途徑抑制氧化應激和纖維化。Zhang等[20]發現黃連素通過激活Nrf2途徑改善DN小鼠的腎小管纖維化及高糖誘導的上皮-間質轉分化，進一步用siRNA沉默Nrf2基因后，黃連素對Nrf2靶基因NQO1表達的誘導作用減弱，說明Nrf2是黃連素的作用靶點之一。此外，研究表明黃連素還可通過核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)途徑抑制腎小管細胞炎癥和纖維化。

目前研究的其它一些中藥及中藥成分，包括雞血藤、杜仲、丹參酚酸A、三七皂苷、五味子素、黃芪甲苷等，均可通過激活Nrf2途徑，抑制細胞氧化應激、炎癥等反應，延緩DN的進展。雖然這些研究尚未進入臨床試驗階段，但就目前研究進展來看具有十分可觀的前景。

4 總 結

Nrf2作為細胞氧化應激反應中的關鍵分子，除維持細胞氧化還原平衡外，還參與細胞抗炎癥、纖維化反應，改善糖脂代謝紊亂、RAS、線粒體功能，并與遺傳易感性有關，目前已成為DN的研究熱點之一。在DN的治療方面，針對Nrf2通路已進行了基礎及臨床試驗，但結果并不理想，而中藥及中藥成分則顯示出明顯的優越性，但仍需進行大量實驗及臨床驗證以排除其嚴重的副作用，以期為DN的預防和治療提供新的方法和思路。