反相高效液相色譜法測定鹽酸左旋米那普侖原料藥中多種雜質

周靈利， 陳維維， 張啟余， 柯 瀟

(成都康弘藥業集團股份有限公司， 四川 成都 610037)

0 引 言

鹽酸左旋米那普侖緩釋膠囊作為成人重性抑郁障礙治療的藥品，于2013年經美國食品藥品監督管理局(FDA)批準上市[1].鹽酸左旋米那普侖作為該制品的原料藥，通過選擇性抑制5—羥色胺(5-HT)轉運體和去甲腎上腺素(NE)轉運體，從而抑制5-HT和NE的再攝取，且其對NE的再攝取抑制能力分別是度羅西汀和文拉法辛的27倍和17倍，具有較好的療效.原料藥的有關物質將直接影響藥品的療效和安全性，為了更好保障鹽酸左旋米那普侖緩釋膠囊的質量，有必要對其原料藥的有關雜質進行控制.目前，國內僅有兩篇該原料藥異構體控制的文獻報告[2-3]，國外有關該原料藥雜質控制的文獻相對較多[4-6].但相關研究都不能完全涵蓋該原料藥中所需要控制的雜質.對此，本研究根據鹽酸左旋米那普侖原料藥的合成工藝和強制降解情況，確定需要控制的雜質(見圖1)，并采用反相高效液相色譜法測定鹽酸左旋米那普侖原料藥中的多種雜質，以對該原料藥的質量進行控制.

1 材料與儀器

1.1 材 料

實驗所用材料包括：鹽酸左旋米那普侖，由成都康弘藥業集團股份有限公司提供；

鹽酸左旋米那普侖對照品(批號，PCL-#-M876)、雜質E(批號，PCL-#-MH14),購自成都邁斯克醫藥科技有限公司；雜質A(批號，2113-074AJ)，購自TLC公司；雜質B(批號，L4X-103302-1411)，購自CATO公司；雜質C(批號，20-MAR-14-01)，購自QCC公司；雜質D(批號，16-02-1823)，購自SINCO公司；三氟乙酸、甲醇、乙腈均為色譜純試劑.

圖1鹽酸左旋米那普侖原料藥雜質譜

1.2 儀 器

實驗所用儀器包括：Ultimate-3000型高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技中國有限公司)，BP-211D型電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司).

2 方法和結果

2.1 測定方法

2.1.1 色譜條件

實驗的色譜條件為：色譜柱為Waters sunfire C18，5 μm，250 mm×4.6 mm；流動相以0.05%TFA水溶液為流動相A，以0.05%TFA乙腈溶液為流動相B，按表1程序進行梯度洗脫；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min；檢測波長220 nm；進樣量10 μL.

表1 梯度洗脫程序

2.1.2 溶液配制

1)供試品溶液.取供試品適量，加10%乙腈溶解并稀釋制成每1 mL約含5 mg的溶液，搖勻，即得.

2)自身對照溶液.精密量取供試品溶液適量，加10%乙腈定量稀釋制成每1 mL約含5 μg的溶液，搖勻，即得.

2.2 結 果

2.2.1 專屬性

取鹽酸左旋米那普侖有關物質A～E與鹽酸左旋米那普侖標準品適量，配制每1 mL含有關物質A～E與鹽酸左旋米那普侖各約含5 μg的混合溶液，作為系統適用性溶液；取鹽酸左旋米那普侖有關物質A～E與鹽酸左旋米那普侖標準品適量至不同的量瓶中，分別配制每1 mL約含5 μg的溶液，作為定位溶液；取以上溶液與10%乙腈(稀釋劑)一起，按“2.1.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，結果如圖2所示.

圖2 專屬性相關液相色譜圖

由圖2可知，各雜質之間以及雜質與鹽酸左旋米那普侖之間分離度均符合要求.

2.2.2 破壞性

取鹽酸左旋米那普侖原料藥適量，加10%乙腈稀釋成每1 mL約含鹽酸左旋米那普侖50.0 mg/mL的溶液，作為儲備液.取該儲備液1 mL分別至8個10 mL量瓶中，按表2中的破壞條件分別加入適量處理溶劑，水浴80 ℃/光下處理相應時間，取出，放冷，加相應試劑中和后，10%乙腈(稀釋劑)稀釋至刻度，搖勻，作為破壞性實驗相關溶液.取以上溶液按“2.1.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，結果如圖3所示.

表2 破壞條件

圖3破壞性實驗液相色譜圖

由圖3可知，樣品在酸、堿、氧化、高溫條件下，均產生雜質B，且各破壞溶液色譜圖中，主峰峰純度及主峰與相鄰雜質的分離度均符合要求.

2.2.3 重復性

取供試品溶液6份，分別取10 μL注入液相色譜儀測定雜質含量.結果顯示，雜質均未檢出，主峰峰面積的RSD為0.4%，小于1%，表明本方法重復性較好.

2.2.4 檢測限和定量限

取左旋米那普侖有關物質A～E溶液，逐步稀釋后進樣10 μL，以信噪S/N約為3和10時的量作為檢測限和定量限.結果表明，雜質A～E檢測限分別為0.1720、0.5270、0.8667、0.8892、0.0631 μg/mL；雜質A～E定量限分別為0.5160、 0.8783、2.600、2.668、0.1683 μg/mL.

2.2.5 溶液穩定性

取“2.2.3”項下一份供試品溶液，于常溫放置1、3、5、6、8、9、16、26 h后測定.結果表明，無新增雜質檢出，主峰峰面積RSD為0.3%，均小于1%，說明常溫下，供試品溶液在26 h內穩定.另取混合對照溶液，于常溫放置1、2、3、4、5、8、12、16、21、29 h后測定.結果表明，雜質A～E的峰面積RSD分別為2.1%、1.7%、3.7%、3.1%、0.25%，均小于4%.結果表明，常溫下，對照溶液在29 h穩定.

2.2.6 耐用性

取鹽酸左旋米那普侖有關物質A～E與鹽酸左旋米那普侖標準品適量，配制每1 mL含有關物質A～E各5 μg和鹽酸左旋米那普侖5 mg的混和溶液，作為耐用性考察溶液.調整色譜條件的流速±0.1 mL/min、柱溫±3 ℃或更換色譜柱，取該溶液進樣.結果表明，在不同條件下，按峰面積百分比法計算各成分的量幾乎不變，雜質與雜質之間以及雜質與左旋米那普侖之間分離度均大于1.5，表明本方法耐用性良好.

2.2.7 線性關系

取鹽酸左旋米那普侖有關物質A～E與鹽酸左旋米那普侖標準品適量，配制每1 mL含有關物質A～E與鹽酸左旋米那普侖各50 μg/mL混和溶液作為線性儲備液，并分別精密量取0.5 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL，置于不同的10 mL量瓶中，分別用10%乙腈(稀釋劑)定容，作為線性關系考察樣品溶液.取以上溶液各10 μL進樣，以濃度和峰面積進行線性擬合.計算結果顯示：雜質A，在2.58～7.74 μg/mL濃度范圍內，回歸方程為Y=0.4731X-0.0353(R2=0.9996)；雜質B，在2.635～7.905 μg/mL濃度范圍內，回歸方程為Y=0.3629X+0.0102(R2=0.9965)；雜質C，在2.6～7.8 μg/mL濃度范圍內，回歸方程為Y=0.1786X-0.0438(R2=0.9895)；雜質D，在2.6675～8.0025 μg/mL濃度范圍內，回歸方程為Y=0.1322X-0.054(R2=0.9982)；雜質E，在2.525～7.575 μg/mL濃度范圍內，回歸方程為Y=1.4049X-0.1972(R2=0.998)；鹽酸左旋米那普侖，在2.500～7.500 μg/mL濃度范圍內，回歸方程為Y=0.3849X+0.0949(R2=0.9963).結果表明，在相應濃度范圍內，有關物質A～E與鹽酸左旋米那普侖的進樣濃度與峰面積線性關系良好.

2.2.8 準確度

取供試品適量，加10%乙腈溶解并稀釋制成每1 mL約含50 mg的溶液，搖勻，作為準確度儲備液，取儲備液1 mL至10 mL量瓶中，分別精密加入0.8、1.0、1.2 mL“2.2.7”項下線性儲備液(每個濃度平行制備3份)，用10%乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為準確度供試液.取準確度供試液及“2.2.1”項下系統適用性溶液各10 μL進樣，供試品各雜質含量均按均未檢出計算，以雜質的測定量和加入量計算回收率.計算結果顯示：雜質A的回收率范圍為95.78%～97.88%，平均回收率為96.6%，RSD為0.69%；雜質B的回收率范圍為97.80%～106.87%，平均回收率為101.5%，RSD為2.8%；雜質C的回收率范圍為91.61%～109.76%，平均回收率為97.33%，RSD為6.5%；雜質D的回收率范圍為90.13%～105.99%，平均回收率為94.9%，RSD為5.7%；雜質E的回收率范圍為98.08%～101.30%，平均回收率為99.6%，RSD為1.0%.結果表明，各雜質回收率范圍均在80%～120%，RSD均≤10%，本方法準確度良好.

3 討 論

3.1 降解雜質結構的確認

實驗顯示，鹽酸左旋米那普侖堿破壞供試液中檢出2個較明顯的雜質，即雜質1和雜質3(見圖4).通過對該溶液進行LC-MS結構解析，初步確定兩降解雜質的分子量分別為192與174，通過對鹽酸左旋米那普侖(分子量247)結構式進行拆分，本研究確定2個雜質的結構式為圖1中的雜質B和雜質D.

圖4供試液堿破壞液相色譜圖

3.2 紫外吸收光譜檢測

“2.2.1”項下雜質A～E和鹽酸左旋米那普侖的定位溶液各主峰光譜圖(見圖5).結果顯示，除雜質E在190 nm、220 nm處有較明顯的吸收峰外，其他雜質和鹽酸左旋米那普侖除在190 nm外，無明顯的吸收峰.為了避開末端吸收(190 nm)的干擾，同時確保各雜質和主成分均有較強的吸收，本研究選擇220 nm作為檢測波長.

圖5雜質與米那普侖光譜圖

3.3 水相添加劑的篩選

相關研究顯示，雜質D極性很強，需要很低比例的有機相，而雜質E極性太差，需要較高比例的有機相.本實驗發現，當以純水為水相時，主峰拖尾嚴重，而以磷酸鹽為水相時，雜質E附近會出現明顯的鬼峰(高比例乙腈與磷酸鹽混合，出現鹽析現象所致)，當以0.05%TFA水溶液為水相時，不僅主峰和雜質峰峰型良好，且雜質E附近基線平穩.

4 結 論

實驗的結果表明，本研究建立的分析方法，各成分分離良好，同時可兼顧極性小的工藝雜質和極性大的降解雜質，具有簡便快速、準確靈敏、重復性好的特點，完全適用于鹽酸左旋米那普侖有關物質測定.