腫瘤微環(huán)境剛性的病機探討?

高卓維，韓欽芮，符秀瓊，姚學清，陳騰祥，孫學剛,△

(1.南方醫(yī)科大學順德醫(yī)院，廣東 佛山 528300；2.南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣州 510515；3.廣東省人民醫(yī)院胃腸外科，廣州 510080；4.貴陽醫(yī)科大學科技處，貴陽 550025)

機體某個部位的硬塊，臨床醫(yī)生會高度懷疑其是否為腫瘤，這提示相比于原有的正常組織，實體腫瘤的硬度增加。腫瘤微環(huán)境的重構(gòu)是“積聚”硬度逐漸增強的主要機制。我們此前提出，在正氣虧虛基礎(chǔ)上，痰凝、血瘀參與腫瘤微環(huán)境的重構(gòu)，導(dǎo)致癌毒結(jié)聚[1-2]?！鹅`樞·百病始生》：“腸胃之絡(luò)傷，則血溢于腸外，腸外有寒，汁沫與血相搏，則并合凝聚不得散，而積成矣”，提示痰瘀可能參與汁血相搏而凝聚成積的過程。因此，從微環(huán)境剛性的角度解析“癥積”病機，有助于建立癥積硬度與免疫調(diào)控之間的聯(lián)系，亦提供軟堅散結(jié)調(diào)控腫瘤免疫的新思路。

1 ECM重構(gòu)促進腫瘤“剛性”微環(huán)境形成

病變部腫塊堅硬如石，高低不平，狀似巖突，故名巖。巖與癌同[3]，這種腫瘤的硬度改變與臨床觸診的常識相符。夫眾病積聚皆起于虛，虛久血瘀痰凝而為癥瘕。腫瘤微環(huán)境中細胞外基質(zhì)(extracelluar matrix,ECM)的動態(tài)重塑是腫瘤剛性調(diào)控的關(guān)鍵機制。一方面是細胞外基質(zhì)蛋白的表達水平與相對組成發(fā)生改變，另一方面ECM空間拓撲結(jié)構(gòu)與剛性等物理學性質(zhì)的改變，使腫瘤組織的硬度顯著高于正常組織[4]。

ECM是圍繞著細胞的三維結(jié)構(gòu)，主要有兩類：一類是主要由IV型膠原蛋白、層黏連蛋白、巢蛋白和蛋白聚糖組成的直接與上皮細胞或內(nèi)皮細胞相互作用的基底膜(basement membrane)；另一類主要由I型和III型膠原蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖、腱糖蛋白組成的間質(zhì)基質(zhì)(interstitial matrix)，它構(gòu)成細胞外基質(zhì)的主體。結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)不同分期的ECM與癌細胞E-鈣黏蛋白(E-cadherin,E-cad)表達呈負相關(guān)，而與整合素αvβ6的表達正相關(guān)，CRC分期越高ECM促進癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)的能力越強[5]。間質(zhì)起源的結(jié)締組織生成(desmoplasia)與CRC的預(yù)后不良和轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)相關(guān)，提示CRC發(fā)生發(fā)展過程伴隨結(jié)締組織生成與纖維化。該過程與《靈樞·百病始生》“溫氣不行，凝氣蘊裹而不散，津液澀滲，著而不去，而積皆成矣”的描述相似。

朱丹溪[6]云：“凡人身上、中、下有塊者，多是痰。”而ECM的過量沉積及其組織形式的異常形成是機體損傷修復(fù)而“成塊”的關(guān)鍵步驟，因此ECM重構(gòu)并在腫瘤微環(huán)境沉積形成“有形之痰”。丹溪學派醫(yī)家認為，痰為津液脾濕所生。我們此前提出脾虛(甚則及腎)是腫瘤微環(huán)境的核心病機，脾胃虛損、中氣匱乏、失其健運之常，遂聚濕而生痰[2,7-8]。《肘后備急方》[9]言：“凡癥堅之起，多以漸生，如有卒覺便牢大，自難治也”，表明自癥積之初，其性漸堅，痰凝日久，終致《靈樞·百病始生》之謂：“虛邪之中人也……稽留而不去，息而成積”，終牢大難治，如《外證醫(yī)案匯編》 云：“正氣虛則為巖。[10]”

2 CAFs是微環(huán)境“硬化”的關(guān)鍵細胞組分

腫瘤微環(huán)境ECM重構(gòu)的核心是活化的成纖維細胞，即腫瘤相關(guān)成纖維細胞(carcinoma-associated fibroblasts,CAFs)。與靜息成纖維細胞相比，活化的成纖維細胞分泌更高水平的細胞外基質(zhì)蛋白增殖更快、活性增強。腫瘤中的成纖維細胞是持續(xù)激活的，因此腫瘤也被稱為是“無法修復(fù)的損傷”[11]。CAFs不斷分泌促進遷移的細胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、腱糖蛋白等，結(jié)合細胞因子和生長因子等并調(diào)控細胞對上述因子的響應(yīng)[12]；CAFs還可以上調(diào)絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶的表達，如賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)促進ECM中的膠原與彈性蛋白聚合并穩(wěn)定ECM；尿激酶型纖溶原激活劑(urokinade-type plasminogen activator,uPA)是纖溶酶酶原激活成纖溶酶必需的；基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase 1,MMP-1)和MMP-3可以降解和重塑ECM，ECM的重塑和膠原蛋白的交聯(lián)引起ECM剛性增強[13]?！兜は姆ǜ接唷吩唬骸胺踩祟^面頸頰身中有結(jié)核，不痛不紅，不作膿者，皆痰注也”[14]，因此CAFs是腫瘤生“痰”之源，所生之痰注逐漸蓄積、隨氣升降、流動不測、黏滯膠著、穢濁腐敗、性趨結(jié)聚而致病。

基底膜與間質(zhì)基質(zhì)共同決定組織的機械強度[4]。CAFs能夠產(chǎn)生不同的膠原和纖維連接蛋白，是間質(zhì)基質(zhì)中合成和沉積ECM所必不可少的；CAFs分泌層黏連蛋白和IV型膠原，為產(chǎn)生基底膜所必需，因此CAFs是腫瘤剛性微環(huán)境形成的決定性細胞組分。

腫瘤微環(huán)境中的CAF活化，導(dǎo)致ECM沉積、炎癥細胞浸潤和血管生成[15]?！峨s病廣要》[16]曰：“血隨氣結(jié)，痰亦緣火相附而升，遂合并而成形質(zhì)。”《丹溪心法·積聚痞塊》[6]云：“氣不能作塊成聚，塊乃有形之物也，痰與食積、死血而成也。”朱丹溪[6]提出“痰挾瘀血，遂成窠囊”，其理論基礎(chǔ)在于痰源于津，瘀本于血，津血互根同源，則痰瘀亦可相互轉(zhuǎn)化、相兼為病。因此，腫瘤微環(huán)境中ECM重塑和血管生成導(dǎo)致痰瘀交結(jié)、機械強度漸增，遂作塊成聚，積聚乃生。

3 CAFs募集MDSCs和TAMs促進免疫抑制和ECM重構(gòu)

活化CAFs上調(diào)chemokine (C-C motif) ligand如CCL2、CCL5和CCL7，并分泌多種生長因子如PDGFα/β、VEGF、SDF-1、HGF、MMPs和 IL-6等，與髓樣細胞的募集呈正相關(guān)，而與T細胞數(shù)量呈負相關(guān)。在小鼠肝腫瘤模型，CAFs活化STAT3-CCL2信號通路，通過募集髓源抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)促進免疫抑制[17]，而CAFs參與形成的CRC免疫抑制微環(huán)境與不良預(yù)后相關(guān)。CAFs募集髓單核細胞(myelomonocytic cells)、MDSCs和TAMs在腫瘤微環(huán)境聚集，釋放TGF-β1、IL-10等免疫抑制因子，限制T細胞在腫瘤細胞近旁(vicinity)的累積，表明積聚剛性的增強進程，同時是以“本虛”免疫抑制微環(huán)境逐步形成并加重的過程。

CCLs招募髓樣細胞和巨噬細胞向腫瘤微環(huán)境遷移和聚集，微環(huán)境中的MDSCs和TAMs釋放大量強血管生成因子，如VEGF-A、VEGF-C、TNF-α、胎盤生長因子、趨化因子CXCL12、CXCL8和bFGF。TAMs還表達一系列蛋白酶，包括uPA、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-12和彈性蛋白酶等。uPA和MMP能夠重構(gòu)和降解ECM，降解的ECM引起生長因子的動員并促使血管細胞遷移建立新微環(huán)境[18]。因此，CAFs募集免疫細胞在微環(huán)境的累積，一方面促進微環(huán)境的ECM重構(gòu)，另一方面則誘導(dǎo)免疫抑制微環(huán)境，形成免疫赦免樣區(qū)域，是腫瘤生長的沃土。因此，抑制CAFs活化能降低I型膠原蛋白的表達，抑制具有多種抗藥性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[19-20]。

腫瘤剛性微環(huán)境一方面提升腫瘤內(nèi)部的組織液壓，降低藥物在腫瘤中的富集利用；另一方面能夠促使TAM從具有免疫清除功能的M1型向免疫抑制的M2型轉(zhuǎn)化，卻限制了細胞毒性T細胞在微環(huán)境的聚集，使腫瘤微環(huán)境維持在免疫抑制的狀態(tài)，如《局方發(fā)揮》云：“自氣成積，自積成痰”[21]，遇瘀血而搏結(jié)，導(dǎo)致窠囊之屬，因?qū)嵵绿撓拗屏四[瘤免疫治療的效果。

4 軟堅散結(jié)調(diào)節(jié)ECM重構(gòu)改善剛性微環(huán)境

《素問·至真要大論篇》曰：“堅者削之”“結(jié)者散之”。漢·張仲景即用鱉甲煎丸治療癥瘕，晉·葛洪善用海藻治療癭瘤。清·陳士鐸《石室秘錄》破解散、神效開結(jié)散等，均以軟堅散結(jié)為治。《雜病源流犀燭》提出：“積聚、癥瘕、痃癖，因寒而痰與血食凝結(jié)病也。[22]”朱丹溪[6]云：“凡積病不可用下藥，徒損真氣，病亦不去，當用消積藥，使之融化，則根除矣。”主張咸以軟之，堅以削之，行氣開痰。針對腫瘤，選用咸寒之品軟堅散結(jié)以消痰積，旨在緩其堅之性，化其堅之形。

來源于骨髓、淋巴結(jié)或脾臟的免疫細胞向腫瘤細胞的募集，參與腫瘤微環(huán)境由軟向硬的轉(zhuǎn)變，也必然涉及機械力的信號改變，因此腫瘤微環(huán)境不僅僅是一個化學概念，ECM幾何結(jié)構(gòu)、空間拓撲結(jié)構(gòu)及硬度等物理學特性可以作為機械信號調(diào)控腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[23-24]。軟堅散結(jié)藥中的硫酸多糖與硫酸糖肽等成分具有軟化腫瘤微環(huán)境的作用[25]?；诖?，我們檢測了扶正化瘀散結(jié)方對小鼠原位CRC移植瘤硬度的作用，發(fā)現(xiàn)扶正化瘀散結(jié)顯著抑制腫瘤的生長并降低其硬度，軟堅散結(jié)藥可能不能有效殺死腫瘤細胞，但可能通過調(diào)節(jié)機械力信號與ECM重構(gòu)改善微環(huán)境的硬度，使解毒抗癌藥直達病所而抑制腫瘤進展。

5 結(jié)語

CAFs的持續(xù)活化誘導(dǎo)細胞外基質(zhì)重塑，微環(huán)境剛性增強；ECM的重構(gòu)誘導(dǎo)整合素的聚集并激活下游信號FAK信號通路，又反過來促進CAFs活化狀態(tài)的維持，CAFs與ECM交互調(diào)控共同形成腫瘤剛性微環(huán)境[26]。“痰之為物，隨氣升降，無處不到”[6]，腫瘤剛性微環(huán)境既是腫瘤生長的窠囊，又是發(fā)生轉(zhuǎn)移的根源。因此，應(yīng)用扶正化瘀散結(jié)法通過調(diào)整微環(huán)境CAFs的活化與ECM重構(gòu)，改善微環(huán)境的剛性，可能是防治腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移的有效策略之一。