高尿酸血癥及其相關疾病中miRNAs作用研究進展

馬冬艷 孫凱琳 高偉微 王毅鵬

(昆明醫科大學附屬延安醫院內分泌科，云南 昆明 650051)

高尿酸血癥(HUA)是指正常嘌呤飲食狀態下，非同日2次空腹血尿酸水平：男大于420 μmol/L，女大于360 μmol/L〔1〕。隨著人們飲食的結構變化，HUA發病率不斷升高〔2〕。Qiu等〔3〕研究表明在中國北部和東北部的健康成年人中HUA患病率高達13.7%。HUA是因體內尿酸生成增多和(或)尿酸排泄減少所致。其中尿酸生成增多約占原發性HUA病因的10%，主要由嘌呤代謝酶的缺陷引起，包括磷酸核糖焦磷酸(PRPP)合成酶活性增高、磷酸核糖焦磷酸酰基轉移酶(PRPPAT)的活性或者濃度增高、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)的一部分缺失、黃嘌呤氧化酶(XO)的活性增強〔4～6〕；尿酸排泄減少約占原發性HUA病因的90%，包括腎小球濾過減少、腎小管重吸收增多、腎小管分泌減少及尿酸鹽結晶沉積〔7〕。HUA可能在很長一段時間內不會引起明顯的臨床癥狀，僅有波動性或持續性血尿酸升高，但尿酸鹽沉積可能已經損害了組織和內臟，實驗證明，HUA不僅僅會導致痛風，而且還是心血管疾病(CVD)和慢性腎臟疾病(CKD)的獨立危險因素〔8，9〕。

miRNA(microRNA)是一種內源性非編碼RNA，被鑒定為基因表達轉錄后的調節因子〔10〕。miRNA大概是19～22個核苷酸的單鏈RNA，靶信使RNA穩定性通過miRNA選擇性地結合到特定位點來調節〔11〕。到目前為止，已鑒定出5 000多個miRNAs，其中miRNAs在多種人類疾病中發揮重要作用，包括癌癥、代謝性疾病和炎癥性疾病。miRNAs主要與目標mRNAs的3′-非翻譯區(3′UTR)結合，導致mRNA降解或mRNA翻譯的抑制〔10〕。研究表明miRNAs可以與目標mRNAs的其他區域結合，從而導致翻譯抑制或激活〔10〕。大約60%的蛋白質編碼基因是被miRNAs在單個或多個細胞通路上調節的。miRNAs在人體體液中以穩定的形式存在，如血漿、唾液和尿液，所以可能是相關疾病的生物標志物〔12〕。

1 HUA發病過程中miRNAs的作用

嘌呤的生成與轉化主要在肝臟中進行，終產物是尿酸，尿酸經腎小球的濾過、腎小管的重吸收、分泌及再吸收等過程，最終通過尿液排出。對于人類，近端小管重吸收在調節尿酸排泄中起關鍵作用〔13〕。影響嘌呤代謝和尿酸排泄過程的任何因素，都有可能導致HUA。

1.1miR-448上調通過抑制XO蛋白的表達降低尿酸的生成 XO是嘌呤核苷酸的一種分解代謝酶，可以催化鳥嘌呤、次黃嘌呤氧化為黃嘌呤，并能繼續催化黃嘌呤轉化為尿酸，是體內尿酸生成的關鍵作用酶。以黃嘌呤氧化酶為作用靶點的黃嘌呤氧化酶抑制劑，通過抑制黃嘌呤氧化酶的作用減少尿酸生成，從而有效降低血尿酸水平。別嘌呤醇是一種嘌呤類似物，結構與次黃嘌呤結構相似，只是分子N7與C8的位置發生了互換，故可抑制XO，從而抑制尿酸的生成，是血清尿酸鹽異常升高的最常見的臨床治療方法〔14〕。Knake等〔15〕在臨床研究中發現別嘌呤醇和呋塞米(速尿)一起用藥時別嘌呤醇降尿酸作用減弱，需要加大別嘌呤醇的用藥劑量才能將尿酸降至目標值，推測速尿可能通過直接與XO作用或阻礙了別嘌呤醇與XO的結合從而影響了別嘌呤醇的降尿酸作用。首先采用熒光素酶法檢測XO的活性發現別嘌呤醇顯示了一種劑量依賴性的XO活性抑制作用，相反，速尿(高達1 200 μmol/L)對XO活性沒有影響，也不改變別嘌呤醇介導的XO抑制作用，此結果排除了速尿直接與XO作用影響嘌呤代謝的推測。其次通過人肝臟細胞(HepG2)的培養，并用別嘌呤醇和速尿進行干預時發現，別嘌呤醇干預HepG2時XO蛋白表達有明顯下調，而速尿單獨或速尿和別嘌呤醇一起干預時XO蛋白表達沒有變化，故首次提出別嘌呤醇降尿酸作用，除了已知的直接抑制XO活性的作用，也可能由于抑制XO蛋白的表達而起作用〔14〕。為了進一步探討別嘌呤醇和速尿對XO蛋白表達的調節作用，最后使用數據庫預測軟件來鑒定調控的miRNAs時發現在XO基因3′UTR上有一個miR-448結合位點，并通過驗證得出別嘌呤醇或速尿干預HepG2時，HepG2 miR-448表達顯著上調，而這兩種藥物的聯合干預時miR-448的表達沒有顯著變化，故推測miR-448可能通過藥物依賴的方式調節XO蛋白表達從而影響尿酸生成，其機制為miR-448上調抑制黃嘌呤氧化酶蛋白的表達導致嘌呤代謝受抑制從而降低尿酸的生成。

1.2miR-34a上調通過抑制尿酸鹽陰離子轉運體(URAT)1的表達減少尿酸的重吸收從而增加尿酸的排泄 尿酸無法自行通過細胞膜，腎臟對尿酸鹽的清除是依靠專門的有機陰離子轉運體(OATs)進行的。URAT1由SCL22A12基因編碼，是一種電中性的尿酸鹽交換子，不受細胞內外pH值和膜電位的影響完成轉運尿酸，其功能是負責尿酸重吸收〔16〕。Hosoyamada等〔17〕發現進行URAT1基因敲除的小鼠血尿酸的水平比正常小鼠顯著提高，提示了URAT1是尿酸的主要轉運體。Enomoto等〔18〕證實尿酸鹽主要是通過URAT1與有機陰離子轉換的，故URAT1是非常重要的尿酸鹽轉運體。若URAT1蛋白的表達減少，則減少尿酸的重吸收、增加尿酸的排泄。因此，降低URAT1表達的藥物可以抑制尿酸的重吸收，促進尿酸的排泄，降低血尿酸。Sun等〔19，20〕研究出中藥“泄濁除痹方(XZCBD)”，可有效降低血尿酸，并采用miRNA表達譜分析方法篩選了使用XZCBD藥物的HUA患者的相關miRNA發現，miR-34a存在顯著差異，且miR-34a的靶位點位于SLC22A12基因3′UTR的331～338位，即URAT1基因3′UTR的271～277位，其上調抑制了URAT1的表達，從而增加了尿酸的排泄。高、中、低劑量的XZCBD均能降低HUA小鼠模型的尿酸水平，各組腎組織中普遍存在URAT1和miR-34a的表達，但隨著治療劑量的增加，URAT1的mRNA表達呈下降趨勢，而miR-34a的表達呈增加趨勢，尿酸水平也隨之降低。因此，miR-34a可能通過藥物劑量依賴的方式調節URAT1的表達從而影響尿酸排泄〔20〕，其機制為miR-34a上調抑制URAT1的表達導致尿酸的重吸收減少從而增加尿酸的排泄。

2 HUA相關心血管疾病和腎臟疾病發病過程中miRNAs的作用

2.1miRNA可能通過影響內皮細胞功能使HUA成為心血管疾病的危險因素 尿酸升高導致的各種各樣的病理生理改變并不完全依賴尿酸結晶鹽的沉積，尿酸本身引起的內皮損傷改變也不容小覷。血管內皮細胞具有一系列復雜的生理功能，如調節血管收縮、舒張和維持血液流變學的穩定，是循環系統發揮正常的生理功能的重要保證，而內皮細胞損傷則是導致多種心血管疾病發病的始動或促進因素。

2.1.1miR-155上調通過抑制內皮型一氧化氮(NO)合酶(eNOS)的表達、降低NO的釋放在高尿酸導致內皮細胞舒張功能障礙的過程中起到了一定的作用 NO是內皮細胞中的eNOS催化L-精氨酸而生成的，是已知的最強的擴張血管因子之一〔21〕。內源性NO的產生依賴于eNOS的活性和表達，eNOS表達減少，NO也生成減少，從而影響內皮細胞的舒張。Zhang等〔22〕使用尿酸培養人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)后比對分析發現尿酸培養組eNOS蛋白的表達下調、細胞上清液中NO含量也下降，且具有統計學意義。然后通過分析工具預測發現人eNOS mRNA的3′UTR存在miR-155的結合序列。為了進行驗證，同時采用雙熒光素酶的報告系統，又證實了之前預測的結果：miR-155 能夠直接靶向調控eNOS的表達。同時在高尿酸環境培養的HUVEC中，miR-155的表達出現了上升的現象，提示miR-155有可能通過調控eNOS的表達下降導致NO釋放減少在高尿酸導致內皮舒張功能障礙的過程中起到了一定的作用。

2.1.2miR-663上調通過抑制轉化生長因子(TGF)-β1的表達、降低磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)的表達在高尿酸導致內皮細胞遷移功能障礙的過程中起到了一定的作用 于善棟等〔23〕報道在高尿酸條件下HUVEC中表達差異最顯著的miRNA是miR-663，高尿酸通過上調miR-663調控TGF-β1的表達從而抑制內皮細胞遷移。HUA患者血清中的miR-663水平也顯著高于正常人，表明這種現象也可能發生在高尿酸患者中。Wang等〔24〕已證明TGF-β1通過抑制PTEN促進內皮細胞遷移，PTEN是一種多功能磷酸酶，其主要底物為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸脂第二信使分子，磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸激活許多下游分子影響遷移〔25〕。Hong等〔26〕證實當TGF-β1過表達時，PTEN的表達降低，促進了內皮細胞的遷移；當PTEN被敲除時，內皮細胞的遷移抑制減弱，然而在高尿酸條件下TGF-β1過表達不能促進內皮細胞的遷移，故提出了一種新的抑制內皮細胞遷移的機制，即miR-663上調通過抑制TGF-β1的表達上調PTEN的表達從而抑制內皮細胞的遷移。

2.1.3miR-92a下調通過促進Kruppel樣因子(KLF)2表達、抑制血管內皮生長因子(VEGF)A表達在高尿酸導致內皮細胞生成血管障礙的過程中起到了一定的作用 血管生成是內皮細胞的一種重要功能。Yu等〔27〕通過HUVEC在高尿酸的環境下和正常環境中培養對比發現高尿酸可抑制血管的形成，如血管長度和數目的減少。同時用微陣列技術對高尿酸刺激的內皮細胞進行miRNA表達譜分析發現miR-92a在高尿酸環境下內皮細胞中表達明顯下調，miR-92a的下調伴隨著血管生成的抑制，表明miR-92a在高尿酸環境下可能是血管生成的正調節因子。Bhattacharya等〔28〕已證明KLF2具有抑制血管生成的作用，位于KLF2下游編碼的VEGFA基因是一種強促血管生成因子，因此推測KLF2可能通過下調VEGFA而抑制血管生成。然后又進一步進行miR-92a過表達實驗發現內皮細胞的KLF2表達降低、VEGFA的表達增加。KLF2基因敲除、VEGFA過度表達等實驗均發現可減輕高尿酸介導的血管生成抑制作用。此外，在檢測HUA患者和正常人血清VEGFA水平時發現HUA患者血清VEGFA水平明顯低于正常人。因此得出結論高尿酸負性調節miR-92a，增加KLF2的表達，抑制VEGFA，導致血管生成減少。內皮細胞舒張功能障礙、遷移功能障礙、新生血管功能障礙均可導致心血管疾病的發生，故miRNA可能參與了HUA相關心血管疾病的發病，使HUA成為了心血管疾病的獨立危險因素。

2.2miRNA可能通過影響纖維化因子使HUA成為腎臟疾病的危險因素

2.2.1miR-519d-3p上調可能通過TGF-β信號通路調節了高尿酸腎病的發生發展 董利平〔29〕采用miRNA基因芯片技術檢測發現有顯著差異表達的miRNAs共11個，分別為miR-30c-2-3p，miR-1284，miR-519d-3p，miR-4682，miR-5004-3p，這5個為上調；miR-5002-3p，miR-487b-3p，miR-374a-5p，miR-30c-5p，miR-589-5p，miR-106b-3p，這6個為下調。又使用實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)在HUA樣本及正常對照樣本中進行驗證顯著上調的miR-519d-3p及顯著下調的miR-30c-5p、miR-374a-5p，驗證結果與芯片法保持一致。進一步進行靶基因預測發現差異表達的miRNA靶基因富集在細胞增殖、信號傳導、轉錄調控等生物學基本功能上，其中表達上調的miRNA中miR-519d-3p預測出的靶基因Smad6、骨形成蛋白和激活素的跨膜抑制劑(BAMBI)及基質金屬蛋白酶(MMP)2均參與了TGF-β信號通路。TGF-β1通過TGF-β1/Smads 信號通路介導的上皮細胞向間質細胞轉化最終導致腎纖維化的機制已被公認〔30〕，尿酸性腎病的腎臟病理改變以腎間質纖維化和腎小球硬化為表現，以腎間質纖維化病變為主，因此推測miR-519d-3p可能通過TGF-β信號通路調節了高尿酸腎病的發生發展。

綜上，miRNA與尿酸的生成、排泄及高尿酸引起心血管、腎臟疾病可能存在密切的關系，但目前此內容在人體實驗、動物實驗、細胞實驗、分子實驗等方面均研究較少，其研究前景廣闊。HUA引起心血管疾病、腎臟疾病的具體作用機制尚不明確，隨著科學的發展、HUA中的miRNAs作用的深入研究，能更好地闡明miRNA在HUA中的作用，為HUA的診治提供新的思路，也為HUA引起的心血管疾病和腎臟疾病提供新的治療靶點。