攝食不同種類餌料的鯉肝臟組織miRNA表達(dá)譜分析及驗證

羅 杰，楊 淞，杜 杰，劉 巧，杜宗君，楊世勇，李勝杰，趙柳蘭

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，成都 611130；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，熱帶亞熱帶魚類選育與養(yǎng)殖重點開放實驗室，廣州 510380)

MicroRNA(miRNAs)是一類內(nèi)源性的、長度為18-25nt的非編碼單鏈小RNA，是一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，廣泛存在于真核生物中[1]。MiRNAs參與調(diào)控主要是與mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)結(jié)合，最終引起靶基因翻譯受阻或者直接導(dǎo)致靶基因降解[2]。在真核細(xì)胞中，miRNA可調(diào)控30%以上的靶基因，參與多種調(diào)控途徑，包括代謝、發(fā)育、分化、免疫等過程[3]。目前miRNA與餌料相關(guān)的研究較少，主要集中在一些miRNAs與一些重要的營養(yǎng)因子的調(diào)控關(guān)系上，包括脂肪酸、葡萄糖、維生素等[4-5]。

肝臟是魚類消化系統(tǒng)的重要組成部分，能分泌大量的消化酶[6]。肝臟是參與生物新陳代謝的重要器官，能參與營養(yǎng)物質(zhì)代謝過程。肝臟還能通過合成尿素參與到生物體的排泄中。肝臟能通過生物轉(zhuǎn)化的作用將一些非營養(yǎng)物質(zhì)，如藥物、毒物等通過新陳代謝徹底分解或以原形排除體外，具有解毒功能。

魚類食性一般分為雜食性、草食性、肉食性三種。魚類對生活環(huán)境中的餌料具有一定的選擇能力，這種選擇能力是由魚類對餌料生物的需求、環(huán)境中這種餌料生物豐度和可獲得程度來決定的[7]。當(dāng)季節(jié)發(fā)生改變時，水環(huán)境pH會發(fā)生改變，從而影響水環(huán)境餌料生物，影響魚類食性形成[8]。不同餌料所含營養(yǎng)物質(zhì)具有差異，能影響魚類生長、免疫和代謝能力[9-10]。鯉，屬于鯉科(Cyprinidae)，以藻類、水生植物以及底棲動物為主要食物，是典型的雜食性魚類。稻田養(yǎng)魚屬于生態(tài)農(nóng)業(yè)，稻田養(yǎng)殖密度相對較低，且稻田中同時含有植物性和動物性餌料，魚類可以選擇水環(huán)境中的餌料生物。在四川、重慶、云南等地區(qū)漁民通常將1-2齡的鯉放入稻田中以提高魚質(zhì)量獲得更高的經(jīng)濟(jì)效益。本團(tuán)隊研究發(fā)現(xiàn)稻田養(yǎng)殖下的大鱗副泥鰍腸道具有更高的免疫酶活性[11]，然而稻田中存在的餌料對魚類的影響尚未研究。本實驗以攝食不種類餌料的鯉肝臟組織為研究材料，采用Illumina HiSeq深度測序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)方法，比較 miRNA 及各組樣品間差異表達(dá)的miRNAs，并分析這些miRNAs可能的靶基因及相關(guān)的調(diào)控通路，為深入了解它們對鯉攝食不同種類餌料的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

實驗魚購自通威水產(chǎn)工程技術(shù)研究中心(成都)，同一批次的健康鯉(498.7±21.9) g。飼養(yǎng)于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，在直徑1 m、高1 m的圓形魚缸中進(jìn)行試驗，魚缸水體約1 m3。保障供氧(溶解氧>6 mg/L)、控制溫度在(21±1) ℃。

1.2 實驗設(shè)計

將90尾鯉分為A、B、C三組，每組30尾，保證每組魚體重差異不顯著，隨機(jī)分配至3個水桶中。

試驗開始前暫養(yǎng)2周，并進(jìn)行馴食，投喂量為魚總體重的4%。A組投喂蚯蚓(動物性餌料)、B組投喂蚯蚓+浮萍(動物性餌料∶植物性餌料=1∶1)、C組投喂浮萍(植物性餌料)，每天定時(9 ∶00、13 ∶00、17 ∶00)投喂。為保障B組鯉攝食餌料為蚯蚓+浮萍，在馴化及試驗過程中，根據(jù)B組魚總體重計算其投喂量，然后按動物性餌料∶1植物性餌料=1∶11先投喂1/2總量的蚯蚓，待蚯蚓吃完后再投喂總量1/2的浮萍，以此類推。暫養(yǎng)結(jié)束后，停飼24 h后，正式實驗8周，饑餓24 h取樣。將魚用MS-222(80 mg/L)麻醉，快速解剖實驗魚取肝臟組織，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 肝臟總RNA提取及質(zhì)量檢測

將備用的肝臟組織取出后在研缽中加入液氮研磨充分，然后參照總RNA提取試劑盒(Invitrogen，美國)使用說明進(jìn)行RNA提取。1%的瓊脂糖電泳檢測 RNA 樣品是否有降解以及雜質(zhì)，NanoPhotometer?分光光度計檢測樣品純度(IMPLEN，CA，USA)，Qubit? 2.0 Fluromete(r Life Technologies，CA，USA)檢測 RNA 樣品濃度，安捷倫 2100 RNA Nano 6000 Assay Kit(Agilent Technologies，CA，USA)檢測 RNA 樣品的完整性。

1.4 MicroRNA文庫的建立與測序

每組分別取1尾魚完整性和純度較好的RNA樣品(c≥200 ng/μL；RIN≥8.0；28S/18S≥1.5) ，分別作為動物性餌料組、植物性餌料組和混合餌料組的 RNA 用于后續(xù)分析。Total RNA樣本，采用15% PAGE膠進(jìn)行小RNA(18-30 nt)分離；分離后的小RNA經(jīng)乙醇沉淀離心富集；富集后的小RNA樣本，根據(jù)TruSeq Small RNA Sample Preparation Kit(Illumina，RS-200-0048)方法及流程進(jìn)行文庫制備。文庫構(gòu)建完成后，先使用Qubit2.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫1 ng/μL，隨后使用 Agilent 2100對文庫的insert size進(jìn)行檢測，insert size符合預(yù)期后，使用Bio-RAD CFX 96熒光定量PCR儀，Bio-RAD KIT iQ SYBR GRN 進(jìn)行Q-PCR， 對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫有效濃度>2 nmol/L)，以保證文庫質(zhì)量。檢測合格的文庫，在HiSeq 2500測序平臺上運(yùn)行單端測序程序(SE50)，得到50 bp的序列reads。HiSeq深度測序由安諾優(yōu)達(dá)基因科技中心完成。

1.5 miRNA測序數(shù)據(jù)的處理和映射

將HiSeq測序獲得的total reads進(jìn)行篩選，剔除3′端接頭缺失、插入片段缺失、5′端污染、長度小于18 nt長于32 nt及含polyA的reads后，將測序質(zhì)量較高的reads去接頭、去污染后得到干凈的序列(clean reads)。

1.6 已知 miRNA 的鑒定與差異分析

使用bowtie2(2.2.3)將高質(zhì)量的clean reads映射到miRBase數(shù)據(jù)庫中列出的鯉基因組[12]，鑒定出已知miRNA。

已知miRNA的差異表達(dá)分析使用edgeR軟件[13]，篩選標(biāo)準(zhǔn)是基因表達(dá)差異倍數(shù)大于2、并且FDR≤0.05為顯著差異的基因。

1.7 實時熒光定量qRT-PCR分析驗證差異miRNA

為了消除個體間差異和增加數(shù)據(jù)代表性，每組隨機(jī)選取6個樣本進(jìn)行熒光定量qRT-PCR驗證。參照1.3提取總RNA，提取的總RNA用miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Synthesis反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Tiangen)進(jìn)行miRNA-cDNA反轉(zhuǎn)錄，具體操作步驟參考說明書。每組6個樣本，每個樣本設(shè)置3個重復(fù)，同時設(shè)不加模版cDNA的作為陰性對照。在CFX Connect熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為:95 ℃ 15 min 預(yù)變性；94 ℃ 20 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán) 40 次。最后，通過融解曲線驗證PCR擴(kuò)增的特異性。U6作為內(nèi)參基因，選取了2.2中共同差異表達(dá)的5個與代謝相關(guān)的miRNA驗證其表達(dá)趨勢，包括ccr-miR-375-3p、ccr-miR-217-5p、ccr-miR-182-5p、ccr-miR-153c-3p和ccr-miR-129b-5p。結(jié)果采用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達(dá)量[14]。用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物并由北京六合華大基因科技有限公司合成相關(guān)引物，引物序列及退火溫度見表1。

表1 qRT-PCR的引物序列及退火溫度Tab.1 Primer and annealing temperature for qRT-PCR validation

1.8 靶基因GO分析及KEGG通路分析

差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測使用mirPath v.3[15]，利用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫對預(yù)測的靶基因進(jìn)行功能分析。通過超幾何檢驗確定了差異表達(dá)miRNA中顯著富集的GO項和KEGG通路。當(dāng)GO條目和KEGG通路P<0.05時，定義為顯著富集的GO條目和KEGG通路。

2 結(jié)果

2.1 miRNA測序結(jié)果

通過深度測序后動物性餌料組，混合餌料組和植物餌料組組獲得的干凈reads，映射Reads，映射率以及每組鑒定出已知miRNAs如表2所示。

表2 鯉肝臟小RNA測序結(jié)果匯總Tab.2 Summary statistics of miRNA sequencing results for the C.carpio libraries

2.2 差異表達(dá)miRNAs分析結(jié)果

分別比較A與B，C與B，A與C兩兩之間的差異表達(dá)miRNAs，結(jié)果顯示A與B比較共有差異表達(dá)miRNA 109個，其中71個上調(diào)表達(dá)，38個下調(diào)表達(dá)；C與B比較共有差異表達(dá)miRNA 126個，其中90個上調(diào)表達(dá)，36個下調(diào)表達(dá)；A與C比較共有差異表達(dá)miRNA 34個，其中11個上調(diào)表達(dá)，23個下調(diào)表達(dá)(圖1a)。三種餌料組兩兩比較共表達(dá)的差異miRNAs有13個，分別為ccr-miR-129-3p，ccr-miR-129-5p，ccr-miR-132a-3p，ccr-miR-153c-3p，ccr-miR-182-5p，ccr-miR-183-5p，ccr-miR-187-3p，ccr-miR-196a-5p，ccr-miR-217-3p，ccr-miR-217-5p，ccr-miR-218a-3p，ccr-miR-218a-5p和ccr-miR-375-3p(圖1b)。挑選了5個已有研究證明的與代謝相關(guān)的miRNA驗證其表達(dá)趨勢，qPCR結(jié)果顯示這些miRNA表達(dá)趨勢與測序結(jié)果基本一致(n=6)，表明測序結(jié)果可信。

圖1 鯉肝臟組織已知miRNAs 差異基因分析Fig.1 Differential miRNA expression analysis of C.carpio(a)A vs B、C vs B以及A vs C的差異表達(dá)基因數(shù)量(P<0.05)；(b)各比較組重疊差異表達(dá)的miRNA的維恩圖

2.3 靶基因預(yù)測及功能分析

使用mirPath v.3預(yù)測靶基因，13個共同差異表達(dá)的miRNAs共有10個miRNAs預(yù)測到了靶基因，分別為ccr-miR-129-3p(39個)，ccr-miR-129-5p(7個)，ccr-miR-132a-3p(40個)，ccr-miR-153c-3p(38個)，ccr-miR-182-5p(83個)，ccr-miR-183-5p(108個)，ccr-miR-196a-5p(22個)， ccr-miR-217-5p(100個)，ccr-miR-218a-3p(102個)和ccr-miR-375-3p(6個)，共預(yù)測到了530個靶基因。

對靶基因進(jìn)行GO及KEGG分析，GO分析結(jié)果顯示這些共表達(dá)的差異miRNAs主要參與發(fā)育過程、脂類代謝過程和細(xì)胞分化等生物過程；參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞核等細(xì)胞組成；酶活性調(diào)節(jié)、分子功能調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)移酶活性等分子功能調(diào)節(jié)(圖2)。KEGG分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)miRNAs主要參與2-羰基羧酸代謝、糖基磷脂酰肌醇(GPI)-錨定生物合成、硫胺素代謝、糖肽類生物合成、檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))、脂肪代謝等通路的調(diào)節(jié)(圖3)。

3 討論

本研究中我們以三組投喂不同類型餌料的鯉的肝臟為研究材料，通過深度測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析miRNA，分別鑒定出219個，226個和223個已知miRNAs。對攝食不同種類餌料的鯉已知miRNAs進(jìn)行差異分析，共表達(dá)的差異miRNAs有13個，其中表達(dá)量最高的3個共同差異表達(dá)miRNAs分別為ccr-miR-375-3p、ccr-miR-217-5p和ccr-miR-182-5p，且三個miRNA均有研究表明與魚類糖代謝和脂代謝相關(guān)。

圖2 差異表達(dá)miRNA的GO分析Fig.2 Analysis of GO on the differential expression of the miRNAs

圖3 差異表達(dá)miRNA的KEGG分析Fig.3 Analysis of KEGG on the differential expression of the miRNAs

MiR-375是一類特異性高表達(dá)于胰腺組織的非編碼小RNA，對胰島B細(xì)胞分化、胰島素分泌及糖、脂代謝具有重要的調(diào)控作用。研究表明，miR-375直接調(diào)控多種胰島組織中特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，參與調(diào)控胰島B細(xì)胞分化、胰島素合成與分泌等生物學(xué)功能[16]。MiR-375還參與脂肪細(xì)胞分化，并與主要在肝臟和脂肪組織中表達(dá)的脂聯(lián)素受體2(AdipoR2)的3′非編碼區(qū)結(jié)合調(diào)控AdiPoR2蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)機(jī)體組織器官的脂代謝過程[17]。動物餌料的脂肪含量顯著高于植物餌料，本研究中動物餌料組miR-375-3p表達(dá)量顯著低于植物餌料組，推測高的脂肪含量抑制了miR-375的表達(dá)。MiR-375可直接作用于糖酵解途徑中的乳酸脫氫酶B的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，影響糖代謝過程，在維持糖穩(wěn)態(tài)方面起重要作用[18]。本研究結(jié)果表明蚯蚓組miR-375-3p表達(dá)顯著低于浮萍組，推測機(jī)體可能通過調(diào)控miR-375的表達(dá)來維持糖穩(wěn)態(tài)。

MiR-217是miRNAs家族的重要成員,參與糖代謝、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞衰老及血管生成等生物過程。MiR-217參與糖代謝主要是通過Sirt1靶基因進(jìn)行作用，研究證明在高糖培養(yǎng)的RMCs中，miR-217通過調(diào)節(jié)Sirt1/HIF-1α通路促進(jìn)炎癥反應(yīng)及纖維化，為Sirt1在糖尿病腎病中發(fā)揮保護(hù)作用[19]。Fiorentino等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在高糖處理后miR-217表達(dá)升高，并通過下調(diào)其靶基因Sirt l的表達(dá)。在本研究中，A組miR-217-5p表達(dá)量顯著低于C組,推測可能是由于浮萍含有更高的淀粉和纖維素導(dǎo)致miR-217表達(dá)升高，但是否是由于下調(diào)其靶基因Sirt l的表達(dá)來實現(xiàn)調(diào)控的還有待進(jìn)一步研究。

MiR-182屬于miR-183/96/182簇(cluster)的一員，在多種細(xì)胞和組織中表達(dá)，參與糖、脂代謝。MiR-182的異常表達(dá)可能導(dǎo)致代謝性疾病發(fā)生[21]。研究證明，在2型糖尿病小鼠模型的血清、胰腺及胰島素敏感組織如肝臟、脂肪和骨骼肌中miR-182的表達(dá)與正常對照組相比顯著下降，表明miR-182在肝臟及其他組織中的低表達(dá)可能參與2型糖尿病的發(fā)生[21]。研究證明miR-182 啟動子的轉(zhuǎn)錄活性可以被脂質(zhì)合成調(diào)控因子SREBP-2(sterol regulatory element-binding proteins 2)激活，而miR-182則通過下調(diào) Fbxw7(F-box and WD repeat domain containing 7)和Insig2(insulin induced gene 2)這兩SREBP的負(fù)調(diào)節(jié)因子間接促進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)SREBP的聚積，從而形成一個內(nèi)源性脂質(zhì)代謝的調(diào)控環(huán)路，表明miR-182 參與了細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝的調(diào)控[22]。在3T3- L1前脂肪細(xì)胞分化過程MiR-182呈下調(diào)趨勢，表明miR-182 可能還參與脂肪細(xì)胞的分化調(diào)控[23]。本研究結(jié)果表明動物餌料組miR-182-5p表達(dá)量低于植物餌料組，推測低的脂肪含量通過提高miR-182-5p的表達(dá)量來抑制脂肪細(xì)胞分化。

除上述高表達(dá)的差異miRNA外，miR-129-5p，miR-218a等也與代謝相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)miR-218 轉(zhuǎn)染后可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的糖代謝水平[24]。MiR-129-5p是miRNA家族成員之一，上調(diào)表達(dá)的miR-129-5p可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[25]。欒文康等[26]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-129-5p后細(xì)胞葡萄糖消耗量和乳酸生成量較對照組均明顯降低，說明miR-129-5p明顯影響了細(xì)胞的糖代謝水平。本研究中動物餌料組和混合餌料組的ccr-miR-218a-3p和miR-129-5p表達(dá)量顯著高于植物餌料組，推測此時動物餌料組和混合餌料組的鯉肝細(xì)胞的糖代謝水平受到了抑制，可能與餌料低的淀粉含量相關(guān)。

本研究對差異表達(dá)的 miRNA 靶基因進(jìn)行 KEGG 注釋，發(fā)現(xiàn)涉及到代謝相關(guān)通路主要有檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))、糖基磷脂酰肌醇(GPI)-錨定生物合成、脂肪代謝等通路的調(diào)節(jié)。三羧酸循環(huán)是三大營養(yǎng)素(糖類、脂類、氨基酸)的最終代謝通路，又是糖類、脂類、氨基酸代謝聯(lián)系的樞紐，此代謝途徑出錯可能導(dǎo)致血糖代謝異常，引發(fā)糖尿病。GPI的核心結(jié)構(gòu)由乙醇胺磷酸鹽、三個甘露糖苷、葡糖胺以及纖維醇磷脂組成，被證實是蛋白與細(xì)胞膜結(jié)合的唯一方式。脂肪代謝途徑是脂肪在細(xì)胞中的合成和降解，包括脂肪分解或儲存以獲取能量，這些脂肪是從食物中獲得的，或者是由動物的肝臟合成的。本研究KEGG注釋結(jié)果顯示，所獲得的差異表達(dá)的miRNA參與鯉的代謝信號通路，推測這些miRNAs在鯉代謝不同營養(yǎng)物質(zhì)中發(fā)揮重要作用，miRNA與對應(yīng)的靶基因可能發(fā)生的調(diào)控作用還有待進(jìn)一步研究。