硫辛酸對草魚脂肪細胞脂質含量及脂代謝相關基因表達的影響

黃陳翠，孫 健，吉 紅，黃小城，邊晨晨

(西北農林科技大學動物科技學院水產動物營養與飼料研究室，陜西咸陽，712100)

草魚(Ctenopharyngodonidellus)是我國淡水養殖的四大家魚之一，由于生長迅速，飼料來源廣等優點，已成為我國主要的淡水養殖對象[1]。2018年我國草魚的年產量超過500萬噸，其產量位居淡水養殖品種之首。同時，草魚作為食用魚類和水生植物治理魚類在全球廣泛養殖[2]。科學家將草魚作為潛在的草食性模式動物，展開了一系列營養、免疫、增殖放流相關的研究[3-5]。另一方面，草魚攝食較高脂質水平日糧時，雖可快速生長并縮短上市周期，但同時會導致其腹腔脂肪過度蓄積，危害其健康，這一問題亟待解決[6,7]。

硫辛酸作為一種集抗氧化、減脂、提高免疫力等功能于一身的化合物，較多的研究報道其可以緩解高脂日糧對小鼠造成的負面影響，降低血脂、膽固醇等[8,9]。過去的研究發現，日糧中添加硫辛酸可以通過Nrf2-Keap1通路增強草魚抗氧化能力，緩解脂質過氧化對草魚的毒性作用[10]，且適宜劑量的硫辛酸可以提高草魚的免疫功能和抗病性[11]。另外，硫辛酸可以通過激活AMPK-ATGL通路增強脂質水解，同時調控PPARα-CPT1促進脂肪酸β-氧化供能，從而減少草魚腹腔脂肪蓄積[12]。腹腔脂肪組織是草魚主要蓄積脂肪的部位，而脂肪組織主要由各類脂肪細胞組成，因此可以通過減少脂肪細胞脂質含量的方法來解決脂肪組織的脂質蓄積問題。然而，硫辛酸能否調控草魚脂肪細胞的脂代謝并減少脂質含量尚不清楚。因此，本試驗在體外研究硫辛酸對草魚成熟脂肪細胞脂代謝的影響，旨在豐富硫辛酸作為新型飼料添加劑在淡水魚類日糧中的應用，同時也為淡水魚類健康養殖提供新思路。

1 材料方法

1.1 試驗材料

主要試劑：DMEMF12培養基(Hyclone)、PBS緩沖液、無脂肪酸牛血清白蛋白(Sigma)、I型膠原酶(Sigma)、硫辛酸(Sigma)、甘油三酯試劑盒(普利萊基因技術有限公司)、甘油試劑盒(南京建成生物工程研究所)、非酯化脂肪酸(NEFA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)、RNAiso Plus (TaKaRa)、分析純的氯仿、異丙醇、無水乙醇、反轉錄試劑盒(TaKaRa)、SYBR?Premix Ex TaqTMII (TaKaRa)等。

主要試驗器材：剪刀鑷子等解剖器材、200目過濾網、移液槍、酶標儀、實時定量-PCR儀等。

1.2 試驗方法

1.2.1 草魚脂肪細胞的分離

從楊凌康樂市場購買體重1 kg左右健康無病的草魚后暫養1 d。重擊頭部致暈后剪斷鰓弓放血，用洗潔精清洗魚體3遍至潔凈。無菌環境下分離腹腔脂肪組織，首先用75%酒精擦拭體表3遍消毒滅菌，用解剖工具緩慢剖開草魚腹腔，分離腹腔脂肪組織。將分離的脂肪組織放入盛裝無血清DMEMF12培養基的燒杯中，稱重記錄。用PBS洗滌脂肪組織3次后，加入等體積的0.1% I型膠原酶酶液消化脂肪組織，消化過程中連續剪碎脂肪組織并攪拌，消化時間為30 min。用有血清培養基終止消化，200目過濾網過濾消化液至50 mL離心管，700g離心10 min。上層漂浮細胞為草魚成熟脂肪細胞，輕輕吸至另一潔凈的50 mL離心管并用PBS緩沖液洗滌三次后，用2%牛血清白蛋白緩沖液重懸備用。

1.2.2 草魚脂肪細胞的培養與處理

硫辛酸處理草魚脂肪細胞的方法參考文獻[13]中的HUFA處理脂肪細胞方法。硫辛酸處理細胞的濃度參考文獻[12]，試驗用含有不同濃度(0、50和200 μmol/L)硫辛酸的2%牛血清白蛋白緩沖液重懸草魚脂肪細胞，細胞濃度為6×105/mL，將細胞均勻地接種在24孔培養板中，放入28 ℃ 5% CO2培養箱中孵育6 h后取出細胞，立即放于冰盒上終止反應，4 ℃離心機700g離心10 min，用移液槍緩慢收集上層脂肪細胞至新的離心管，另外收集下層培養液。其中每個處理12個重復，每三個重復的樣品混合為一個樣本。

1.2.3 甘油三酯、甘油和非酯化脂肪酸檢測方法

將收集的脂肪細胞用PBS洗滌兩次后，加入400 μL細胞裂解液，將細胞裂解后，用于檢測草魚脂肪細胞甘油三酯含量及蛋白濃度。培養液用于檢測脂肪細胞甘油和非酯化脂肪酸的釋放量。

草魚脂肪細胞甘油三酯含量和蛋白濃度，培養基甘油和非酯化脂肪酸含量的檢測方法分別按照甘油三酯試劑盒(普利萊基因技術有限公司)、甘油試劑盒(南京建成生物工程研究所)、非酯化脂肪酸(NEFA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書執行。

1.2.4 RNA提取和實時定量PCR

按照文獻[14]中草魚成熟脂肪細胞總RNA的提取方法進行總RNA的提取和濃度測定，每個處理12個重復，每3個重復的樣品混合為一個樣本。使用反轉錄試劑盒(TaKaRa)反轉得到cDNA備用。試驗采用CFX96實時定量PCR檢測系統，定量引物見表1，反應體積為20 μL，包含10 μL 2×SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ，7.8 μL 雙蒸水，1 μL cDNA 和各0.6 μL的引物。整個反應過程是95 ℃，30 s，然后95 ℃，5 s，最后60 ℃，30 s，40個循環。反應結束后，利用溶解曲線對產物的唯一性進行分析。β-actin作為內參，相對定量法比較CT2-ΔΔCt，計算基因表達量。

表1 實時定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences used for real-time PCR analysis of mRNA expression

注：TG：甘油三酯；NEFA：非酯化脂肪酸；ATGL：脂肪甘油三酯脂酶；HSL：激素敏感性甘油三酯脂肪酶；MGL：單酰甘油脂肪酶；PPARα：過氧化物酶體增殖物激活受體α；CPT1：肉毒堿棕櫚酰基轉移酶1；LPL：脂蛋白酯酶；CD36：脂肪酸轉移酶；Leptin：瘦素；TNFα：腫瘤壞死因子-α；SREBP-1c：固醇調節元件結合蛋白1c；FAS：脂肪酸合成酶；ACC：乙酰輔酶A羧化酶；DGAT：甘油二酯酰基轉移酶；PPARγ：過氧化物酶體增殖物激活受體γ；GyK：甘油激酶

1.3 數據分析

試驗數據采用SPSS 21.0 軟件分析。試驗結果用平均值或者平均值±標準差表示。使用SPSS的單因素方差分析法(one-way ANOVA)和Duncan多重比較分析甘油三酯、甘油和非酯化脂肪酸的統計學差異。基因表達數據采用SPSS的獨立樣本T檢驗進行分析。差異水平為P<0.05。使用GraphPad Prism 5 (Graphpad Software，San Diego，CA)軟件作圖。

2 結果

2.1 硫辛酸對草魚脂肪細胞甘油三酯含量的影響

硫辛酸對草魚脂肪細胞甘油三酯含量的影響結果見圖1。50和200 μmol/L硫辛酸孵育草魚脂肪細胞6 h均可顯著降低細胞甘油三酯含量。

圖1 硫辛酸對草魚脂肪細胞甘油三酯含量的影響Fig.1 The effect of α-lipoic acid on triglyceride content of adipocyte in C.idellus 數據以平均值±標準差表示，不同字母上標表示差異顯著，下同

2.2 硫辛酸對草魚脂肪細胞甘油和非酯化脂肪酸釋放量的影響

硫辛酸對草魚脂肪細胞甘油和非酯化脂肪酸釋放量的影響結果見圖2。50 μmol/L硫辛酸對草魚脂肪細胞甘油和非酯化脂肪酸(NEFA)釋放量無顯著影響，200 μmol/L硫辛酸極顯著增加草魚脂肪細胞甘油和NEFA釋放量。

圖2 硫辛酸對草魚脂肪細胞甘油和非酯化脂肪酸釋放量的影響Fig.2 The effect of α-lipoic acid on the release of glyoerol and non-esterified fatty acid (NEFA) of adipocyte in C.idellusA：培養基甘油含量；B：培養基非酯化脂肪酸(NEFA)含量。

2.3 硫辛酸對草魚脂肪細胞脂代謝相關基因表達的影響

2.3.1 硫辛酸對脂肪分解相關基因表達的影響

如圖3A所示，200 μmol/L硫辛酸處理草魚脂肪細胞6 h后，顯著增加HSL的mRNA表達，對ATGL和MGL的mRNA表達無影響。硫辛酸對脂肪酸β-氧化相關基因的表達結果見圖3B，200 μmol/L硫辛酸顯著增加草魚脂肪細胞PPARα、CPT1和CD36的mRNA表達，對LPL的mRNA表達無顯著影響。另外，200 μmol/L硫辛酸處理草魚脂肪細胞6 h對脂肪細胞因子Leptin和TNFα的mRNA表達無顯著影響(圖3C)。

2.3.2 硫辛酸對脂合成基因表達的影響

圖3 硫辛酸對草魚脂肪細胞脂肪分解相關基因表達的影響Fig.3 The effect of α-lipoic acid on mRNA expression of the genes related to lipolysis of adipocyte in C.idellus 數據以平均值±標準差表示，“**”表示差異極顯著，下同

圖4 硫辛酸對草魚脂肪細胞脂合成相關基因表達的影響Fig.4 The effect of α-lipoic acid on mRNA expression of the genes related to lipogenesis of adipocyte in C.idellus

如圖4所示，200 μmol/L硫辛酸極顯著增加ACC和PPARγ的mRNA表達，對SREBP-1c、FAS、DGAT2和GyK的mRNA表達無顯著影響。

3 討論

硫辛酸是一種具有抗氧化、提高免疫力、調節營養代謝等功能的自然化合物，作為一種新型飼料添加劑已在陸上動物養殖中得到了較為廣泛的研究。日糧中添加硫辛酸對哺乳動物的降脂功能已經得到確認，有研究指出，在高脂或高膽固醇日糧中添加硫辛酸可以降低總血脂、甘油三酯和膽固醇含量[15,16]。Jia等[17]研究發現日糧中添加硫辛酸也能顯著降低肉雞血清甘油三酯(TG)含量和增加非酯化脂肪酸(NEFA)的含量。另外，硫辛酸可以增強肉雞肝臟和脂肪組織的脂質代謝，離體情況下增加其脂肪細胞的甘油釋放量[18]。Shi等[12]研究發現硫辛酸可顯著降低脂質蓄積肝細胞的甘油三酯含量。在3T3前體脂肪細胞的研究發現，硫辛酸可以抑制脂肪細胞早期分化，在分化后7天，硫辛酸顯著降低了脂質含量[19]。目前尚無有關硫辛酸在魚類脂肪細胞上的研究，本研究發現200 μmol/L硫辛酸處理草魚脂肪細胞處理6 h后，細胞甘油三酯含量下降，且草魚成熟脂肪細胞的甘油和NEFA的釋放量顯著增加。相似的結果在3T3脂肪細胞中也有發現，250 μmol/L硫辛酸處理孵育成熟的3T3脂肪細胞6 h后，處理組比對照組甘油釋放量顯著上升且差異最大，100 μmol/L硫辛酸處理3 h后非酯化脂肪酸顯著高于對照組[20]。為了進一步探究硫辛酸對草魚脂肪細胞脂代謝的調控作用機制，本試驗對脂質代謝的相關基因表達情況進行了檢測。

甘油三酯的水解是脂肪分解的重要組成部分，該過程必須通過脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)、激素敏感性甘油三酯脂肪酶(HSL)和單酰甘油脂肪酶(MGL)三類脂肪酶的連續作用才會產生甘油和非酯化脂肪酸[21]。本研究發現200 μmol/L硫辛酸處理顯著增強HSL mRNA的表達，對ATGL和MGL mRNA的表達無影響。之前的研究發現250 μmol/L硫辛酸顯著上調脂質蓄積草魚肝細胞ATGL和HSL mRNA的表達，并降低肝細胞TG含量[12]。與本研究結果不同的原因可能是由于硫辛酸對不同類型細胞的脂質水解的調控不同，即這種差異與脂肪細胞和肝細胞的不同有關。硫辛酸處理3T3脂肪細胞得到和本研究類似的結果，硫辛酸通過激活HSL磷酸化促進脂肪分解，對ATGL和G0S2的蛋白表達無影響[20]。另一方面，本研究結果表明硫辛酸可以顯著增強草魚脂肪細胞脂肪酸β-氧化相關基因(PPARα和CPT1)mRNA表達，這一結果和前人的研究結果相同[8,12]。

脂質代謝是一個動態調節的過程，表觀的脂質含量是脂質分解代謝和合成代謝的綜合體現。本研究發現硫辛酸可以上調草魚脂肪細胞的脂質合成部分基因(ACC和PPARγ)mRNA的表達，對其他脂質合成基因表達無顯著影響。乙酰輔酶A羧化酶(ACC)是脂肪酸合成的重要限速步驟，關系到甘油三酯(TG)的底物濃度[22]。與本研究結果相反，前人研究報道飼喂硫辛酸日糧會降低乙酰輔酶A羧化酶(ACC)和脂肪酸合成酶(FAS)的基因表達，抑制小鼠的脂質合成[23]。硫辛酸能夠降低小鼠肝臟脂質含量，也是通過抑制肝臟脂肪酸合成[24]。草魚脂肪細胞的過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)可以刺激甘油激酶(Gyk)的活性，而Gyk可以直接使脂質水解產生的甘油成為TG合成的直接原料-3-磷酸甘油[25]。而本研究發現硫辛酸增加草魚成熟脂肪細胞PPARγ mRNA表達卻并沒有導致Gyk mRNA表達上升。實際上，PPARγ在人類的內臟脂肪細胞和肝細胞中除了調節脂質合成外，激活后可調節脂肪酸氧化酶系，促進脂質的氧化代謝[26]。本研究中PPARγ的mRNA表達上調可能是由于硫辛酸激活了PPARγ促進脂質氧化代謝的功能。