Exocyst敲減對腎足細胞缺失及功能紊亂的影響*

許曉麗，何志婷

西安市第九醫院腎臟內科(西安 710054)

腎足細胞丟失和功能紊亂是世界范圍內終末期腎病的主要原因[1]。由于現有的治療嚴重不足和較大毒性，對腎足細胞發育和體內平衡的早期分子事件研究，已被認為是治療腎足細胞損傷和功能紊亂的有效方法。腎足細胞中裂孔膜蛋白Nephrin和Neph1是維持腎小球濾過組裝和功能的獨特組織，能通過腎足細胞結構和功能變化的信號級聯來調節腎足細胞的功能[2]，但目前對參與將這些蛋白轉運到正確的發育和穩態位置的潛在機制知之甚少。確定這些機制可為治療和干預腎小球損傷后腎足細胞功能障礙提供新的靶點。Exocyst是高度保守的由Exoc1-8組成的八聚合體蛋白，可介導囊泡運輸膜蛋白的靶向對接[3]。此外，腎足細胞Exocyst復合體也被證明在患有可影響腎臟疾病的家族性疾病中發生突變[4]，然而， Exocyst復合體在腎足細胞生物學中的作用尚未得到研究。我們通過在腎足細胞中采用shRNA敲減Exoc5，研究Exocyst復合物在腎足細胞丟失和功能紊亂中的作用。

材料與方法

1 主要試劑和儀器 人腎足細胞系購于中科院ATCC細胞庫。DMEM高糖培養基、0.25%胰酶、胎牛血清和購于美國康寧公司。胰島素/轉鐵蛋白購于美國Sigma公司。鏈霉素、青霉素購于美國Roche公司。Exoc5慢病毒轉導shRNA顆粒，購自美國Sigma公司(目錄號：SHCLNV-NM_006544，編號TRCN000

0061963、TRCN0000061964、TRCN0000061965)。Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒購于美國BD公司。

2 細胞培養 腎足細胞在DMEM高糖培養基中培養，加入10%熱滅活胎牛血清、鏈霉素(200 U/ml)、青霉素(10 IU/ml)混合液和10%非必需氨基酸，于37℃、5%CO2細胞孵箱中進行培養。在細胞達到80%～90%的融合量時進行傳代培養。

3 shRNA敲減Exoc5細胞構建 用Exoc5特異性shRNA在培養的人腎足細胞中敲除Exoc5。為使shRNA靶向Exoc5，我們篩選了任務慢病毒轉導顆粒shRNA。shRNA質粒轉染采用Lipofectamine RNAi MAX(Invitrogen)按照制造商說明書進行。轉染后的細胞在2.5 g/ml 嘌呤霉素的培養基中培養，以獲得穩定的慢病毒轉染。

4 免疫熒光 腎足細胞鋪板后24 h，分別采用Nephrin和Neph1抗體進行免疫熒光染色[5]，結束后用萊卡共聚焦顯微鏡拍攝圖像。每組實驗分三組獨立進行，圖像采集于徠卡共焦顯微鏡(Leica TCS SP5)上。

5 活細胞顯微鏡觀察囊泡 將含有和不含Exoc5敲減的熒光探針Neph1表達的腎足細胞置于35 mm玻璃底細胞培養皿培養，用實時成像顯微鏡分析含有Neph1的囊泡運動，含Neph1囊泡的位移隨時間變化。采用徠卡共焦顯微鏡(Leica TCS SP5)，每隔10 s間隔拍攝2 min圖像[6]，使用Image J軟件進行圖像分析。每個實驗至少重復三次。在每組實驗中，每個蓋玻片上200萬個細胞，并對10個或更多的細胞進行定量分析。

5.1 細胞凋亡檢測：含有和不含Exoc5敲減的腎足細胞接種于6孔板內，各組細胞采用0.25%胰酶消化收集，0℃PBS洗滌后重懸于緩沖液中，細胞密度為2×106個/ml。按照AnnexinV細胞凋亡試劑盒說明書用含有TdT和熒光素dUTP的TUNEL反應混合物孵育，流式細胞儀用于檢測各組細胞凋亡率。

5.2 實時熒光定量PCR(RT-PCR)：定量RT-PCR法檢測Exoc5敲減培養的腎足細胞Exocyst組分(Exoc1-8)的表達等。特異性引物采用Gene runner進行設計。引物序列見表1。Trizol試劑提取腎足細胞總RNA，定量RT-PCR實驗使用CFX96實時熱循環(Bio-Rad)設備和SYBR預混料進行。使用的熱循環條件為：初始循環為95°C，持續3 min；40個循環為95°C，持續10 s；60°C，持續30 s。通過分析設備產生的解離曲線，評價擴增產物的特異性。采用三個獨立的RNA樣本進行分析。以編碼肌動蛋白的基因作為標定基因，基因的相對表達量采用2-ΔΔCT表示。

表1 各基因引物序列

6 統計學方法 數據采用GraphPad Prism 7.0統計學軟件進行分析。所得實驗結果以均數±標準誤表示，采用One-Way ANOVA進行組間樣本均數間差異分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 Exoc5敲減誘導腎足細胞凋亡 流式細胞結果表明，對照組細胞凋亡率為5.82%±1.16%，Exoc5敲減-1細胞凋亡率為12.45%±0.80%，Exoc5敲減-2細胞凋亡率為10.93%±1.15%，Exoc5敲減-3細胞凋亡率為14.31%± 0.98%。與對照組相比，Exoc5敲減可使腎足細胞凋亡明顯升高(P<0.01)。此外，Exoc5敲減腎足細胞凋亡相關蛋白Caspase-3的表達水平明顯升高(P<0.01)，圖1。以上結果表明，Exoc5敲減可誘導腎足細胞凋亡。

注：與對照組比較，**P<0.01

2 敲減腎足細胞中Exoc5導致裂孔膜蛋白Nephrin和Neph1錯誤定位 為研究Exocyst缺失導致腎足細胞損傷的機制，我們使用Exoc5特異性shRNA構建Exoc5敲減培養的人類腎足細胞(P<0.01)(圖2A)。Exoc5敲減腎足細胞除了Exoc5的缺失外，其他Exocyst組分均表達下調 (P<0.05)(圖2B)。另外，免疫熒光顯示裂隙隔膜蛋白Nephrin和Neph1在Exoc5敲減腎足細胞中定位錯誤，Exoc5敲減腎足細胞內源性Nephrin和Neph1在細胞-細胞交界處的膜定位表達顯著降低(圖2C、2D)。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 Exoc5敲減腎足細胞中過表達Exoc5可挽救Nephrin和Neph1定位 采用Exoc5慢病毒對體外培養的人Exoc5敲減腎足細胞進行挽救。如圖3所示。免疫熒光用標記抗體進行表面染色，結果顯示，外源過表達Exoc5后，腎足細胞內Nephrin和Neph1在腎足細胞細胞膜上的定位顯著恢復。在每個實驗中，每個蓋玻片鋪200萬個細胞，并對10個以上細胞進行定量分析和統計分析。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

4 Exoc5敲減腎足細胞中熒光探針Neph1囊泡運動減少 在對照或Exoc5敲減背景下，表達熒光探針Neph1的腎足細胞鋪在玻璃底細胞培養皿上，利用延時實時成像分析含有Neph1囊泡的運動。囊泡的運動被繪制成位移(μm，y軸)與時間(s，x軸)的關系。結果如表2顯示，Exoc5敲減腎足細胞中熒光探針Neph1囊泡的位移(μm)和速度(μm/s)下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 Exoc5敲減腎足細胞中囊泡運動減少

注：與對照組比較，*P<0.05

討 論

目前，多項動物實驗及臨床研究已證實腎足細胞損傷是參與各種原發性或繼發性腎小球疾病等腎病綜合征進展的關鍵因素[7-8]。且由于腎足細胞的減少和損傷是不可逆的，研究腎足細胞損傷的機制并加以治療干預顯得尤為重要。盡管腎足細胞中裂孔膜蛋白是維持腎小球濾過組裝和功能的獨特組織，但對于參與將這些蛋白轉運到正確的發育和穩態位置的潛在機制知之甚少[9]。通過分析人類腎病綜合征病例的基因結構變化，發現有患者出現罕見的Exoc4雜合缺失。這表明高度保守的Exocyst胞外轉運復合物的破壞可能與腎足細胞功能紊亂有關[10-11]。因此，我們在本研究中探討Exocyst敲減對腎足細胞缺失及功能紊亂的影響，以期為腎小球損傷后維持腎足細胞功能的治療干預提供新的靶點。

Exocyst是由Exoc1-8組成的高度保守的八聚合體蛋白，參與多種細胞過程，包括細胞極性、纖毛形成和蛋白質翻譯等[12-13]。盡管Exocyst復合體是一種八聚體蛋白復合體，但Exoc5是Exocyst復合體的中心組分，缺失Exoc5則會導致Exocyst復合體解體[14]。腎足細胞Exocyst復合體和Exoc5也被證明在可引起腎病綜合征的家族疾病中發生基因突變[15]，然而，其具體機制仍不清楚。基于上述文獻調研，我們提出Exocyst可能調控腎足細胞裂孔膜蛋白Nephrin和Neph1信號和轉運，從而調節腎足細胞的發育和功能。本研究中，我們通過構建shRNA敲減Exoc5腎足細胞，進一步研究Exocyst復合物在腎足細胞缺失和功能紊亂中的作用。結果表明，Exoc5的丟失導致腎足細胞凋亡增加。我們進一步證明腎足細胞裂孔膜蛋白Nephrin和Neph1的錯誤定位是造成這種表型的主要因素。具體說來，免疫熒光顯示敲減腎足細胞中Exoc5導致裂孔膜蛋白Nephrin和Neph1錯誤定位，而在Exoc5敲減腎足細胞中過表達Exoc5可挽救Nephrin和Neph1定位。此外，延時實時成像分析顯示Exoc5敲減腎足細胞中熒光探針Neph1囊泡運動減少，表明Exoc5敲減后腎足細胞凋亡且其功能下降。

盡管如此，本研究仍存在一定程度上的局限性。比如，本研究僅采用了體外的人腎足細胞模型進行研究，進一步實驗仍需采用Exoc5基因敲除動物模型，以更加全面地研究和驗證Exoc5敲除對腎足細胞的作用以及腎病綜合征的影響。另外，本研究揭示了Exoc5敲減后腎足細胞凋亡且其功能下降，但Exocyst特別是Exoc5是如何誘導腎足細胞凋亡和功能紊亂的潛在機制尚有待深入探索，以期尋找有效的治療腎病綜合征祖細胞病的新靶點。

綜上所述，本實驗研究數據表明，Exocyst家族的重要組分Exoc5敲減可導致腎足細胞凋亡增加，促使裂孔膜蛋白Nephrin和Neph1的錯誤定位和囊泡運動減少，可能是腎足細胞損傷和功能紊亂的重要原因。提示了Exocyst對腎病綜合征腎足細胞病的潛在治療作用以及可能的治療靶點。