五味子乙素改善糖酵解反應(yīng)大鼠心肌缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)研究*

武衛(wèi)黨，郭繼文，張丹鳳，耿蓬勃，路 艷，石 磊

西電集團(tuán)醫(yī)院(西安 710077)

心肌缺血再灌注損傷是臨床常見疾病，多發(fā)與急性心肌梗死的冠狀動(dòng)脈介入治療(Percutaneous coronary intervention，PCI)等，往往導(dǎo)致心肌梗死患者的術(shù)后治療及恢復(fù)，是目前臨床亟待解決的問題[1]。缺血再灌注損傷的作用機(jī)制復(fù)雜，目前主要的作用機(jī)制包括，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、鈣超載、能量代謝障礙等多種學(xué)說。線粒體是細(xì)胞能量供應(yīng)的關(guān)鍵，心肌細(xì)胞線粒體損傷可以導(dǎo)致心肌能量代謝障礙的發(fā)生，導(dǎo)致ATP功能減少，而能量代謝可以進(jìn)一步加劇細(xì)胞損傷的發(fā)生[2-3]。

五味子乙素是五味子果實(shí)中含量最豐富、生物活性最高的一種二芐基環(huán)辛二烯衍生物。是治療病毒性和化學(xué)性肝炎的常用中藥[4]?，F(xiàn)代藥理研究已證明其具有抗氧化、抗炎、心臟保護(hù)、肝保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)和腎保護(hù)作用[5]。近年的研究發(fā)現(xiàn)五味子乙素在心臟相關(guān)疾病中具有一定的保護(hù)作用，目前研究發(fā)現(xiàn)包括其在心肌梗死、阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡具有顯著的改善作用，同時(shí)對(duì)糖尿病血流變也具有改善作用[6-7]。糖酵解是機(jī)體在無氧條件下，維持細(xì)胞能量代謝的補(bǔ)充手段之一，研究發(fā)現(xiàn)促進(jìn)糖酵解反應(yīng)可以顯著改善缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損傷的發(fā)生[8]。而目前圍繞五味子乙素在缺血再灌注損傷中能量代謝障礙的調(diào)節(jié)作用及其對(duì)糖酵解反應(yīng)的影響作用，尚未見報(bào)道。因此本研究將采用離體心臟缺血再灌注模型，考察五味子乙素對(duì)離體心臟血液流變學(xué)，氧化應(yīng)激及能量代謝的影響作用。

材料與方法

1 材 料 健康雄性SD大鼠30只，體重180～220 g，10～15周齡，購(gòu)自于西安醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。正常條件下，自由飲食，飲水適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d用于實(shí)驗(yàn)。

2 試劑及設(shè)備 五味子乙素(sigma， A4589)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(建成生物醫(yī)學(xué)工程研究所，中國(guó))，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)，Caspsase-9(碧云天生物技術(shù)公司，中國(guó))；ATP含量，乳酸(Bivision公司，美國(guó))；離體工作心灌流裝置(美國(guó)RADONTI公司)，生物機(jī)能檢測(cè)系統(tǒng)(Powerlab system，AD Instrument Ltd.澳大利亞)，酶標(biāo)儀(BioTek公司，美國(guó))。

3 模型制備 采用Langendorff離體心臟灌流技術(shù)建立大鼠離體心肌缺血再灌注模型，模型建立方法，腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉大鼠。大鼠心臟置于4 ℃的生理鹽水中，Langendorff灌流裝置上安裝大鼠心臟，逆行恒壓灌注，剪開右心房，使冠脈流出液自然流出。采用95% O2+5%CO2混合氣飽和的K-H 緩沖液(pH 值7.35～7.40) 在恒溫(37 ℃) 、恒壓(100 cm H2O) 條件下灌注。將連接有測(cè)壓導(dǎo)管的心室球囊送入左心室，采用多導(dǎo)生理記錄儀檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。灌注液及心臟周圍溫度用恒溫循環(huán)水浴維持在37 ℃。平衡灌注30 min，待心臟各項(xiàng)功能穩(wěn)定，關(guān)閉灌流液停止灌流，造成全心缺血，31 min 后打開灌流液再?gòu)?fù)灌30 min[10]。

4 血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè) 采用生物機(jī)能檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)離體心肌左室發(fā)展壓(LVDP)、左室內(nèi)壓上升/ 下降速率(±dp/dt)和心率(HR)，考察五味子乙素對(duì)其的影響。

5 心肌組織中SOD、GSH-Px活性、MDA含量檢測(cè) 采用SOD、GSH-Px、MDA試劑盒，檢測(cè)心肌組織中SOD、GSH-Px活性、MDA 含量，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

6 心肌組織中Caspase-3、Caspase-9活性含量檢測(cè) 采用Caspase-3、Caspase-9試劑盒，檢測(cè)心肌組織中Caspase-3、Caspase-9活性，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

7 心肌組織中ATP、乳酸含量檢測(cè) 采用ATP、乳酸試劑盒，檢測(cè)心肌組織中ATP、乳酸含量，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)數(shù)據(jù)比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 五味子乙素對(duì)心肌血流動(dòng)力學(xué)左室發(fā)展壓(LVDP)、心率(HR)、左室內(nèi)壓上升/ 下降速率(±dp/dt)max的影響 考察五味子乙素在缺血再灌注大鼠模型中的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果模型大鼠心臟LVDP、HR、(±dp/dt)max與空白組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給予五味子乙素干預(yù)后，給藥組大鼠心肌組織相關(guān)血流變指標(biāo)LVDP、HR、(±dp/dt)max與模型組比較均有顯著差異，給予模型大鼠心肌灌流糖酵解抑制劑后，心肌相關(guān)LVDP、HR、 (±dp/dt)max與空白組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但繼續(xù)給予五味子乙素干預(yù)后，對(duì)心肌血流變沒有顯著改善作用，與抑制劑組比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 五味子乙素對(duì)心肌血流動(dòng)力學(xué)LVDP、HR、(±dp/dt)max的影響

注：與空白組比較，*P< 0.01 ；與模型組比較，△P<0.05

2 五味子乙素對(duì)心肌組織中SOD、MDA、 GSH-Px含量的影響 考察五味子乙素在缺血再灌注大鼠模型中的對(duì)心肌組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果模型大鼠心臟SOD、MDA、 GSH-Px含量與空白組比較具有顯著差異，SOD及 GSH-Px顯著降低，而 MDA含量顯著升高(P<0.05)。給予五味子乙素干預(yù)后，給藥組大鼠心肌組織相關(guān)SOD、MDA、 GSH-Px含量與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，可顯著恢復(fù)抗氧化酶SOD及 GSH-Px，抑制MDA的升高。給予模型大鼠心肌灌流糖酵解抑制劑后，心肌相關(guān)氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)與空白組比較具有顯著差異，聯(lián)合給予五味子乙素干預(yù)后，五味子乙素對(duì)心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)沒有顯著改善作用，與單一抑制劑組比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 五味子乙素對(duì)心肌組織中SOD、MDA、 GSH-Px含量的影響

注：與空白組比較，*P<0.01 ；與模型組比較，△P<0.05

3 五味子乙素對(duì)心肌組織中Caspase-3活性、ATP、乳酸含量的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果模型大鼠心臟ATP，與空白組比較顯著降低，乳酸含量顯著升高且均具有顯著差異，此外線粒體相關(guān)指標(biāo)Caspase-3活性顯著升高(P<0.05)。給予五味子乙素干預(yù)后，給藥組大鼠心肌組織相關(guān)ATP含量顯著恢復(fù)，乳酸含量進(jìn)一步升高且與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同時(shí)可明顯抑制線粒體損傷相關(guān)指標(biāo)Caspase-3的活性。給予模型大鼠心肌灌流糖酵解抑制劑后，心肌相關(guān)線粒體損傷指標(biāo)及能量代謝指標(biāo)與空白組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而聯(lián)合給予五味子乙素干預(yù)后，五味子乙素對(duì)心肌Caspase-3活性，ATP，乳酸含量均沒有顯著改善作用，與單一抑制劑組比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 五味子乙素對(duì)心肌組織中Caspase-3，Caspase-9活性、ATP、乳酸含量的影響(μg/mg)

注：與空白組比較，*P<0.01 ；與模型組比較，△P<0.05

討 論

缺血再灌注損傷(I/R)是心臟手術(shù)和器官移植的重要組成部分，是發(fā)病率和病死率的主要決定因素。I/R后的心臟保護(hù)仍然亟待解決的問題。在生理?xiàng)l件下，充足的氧氣供應(yīng)是維持心臟活力和功能必不可少的。在缺血相關(guān)缺氧期間，由于缺氧和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，心肌內(nèi)發(fā)生了一系列突然的生化和代謝變化。低氧停止氧化磷酸化，導(dǎo)致線粒體功能障礙、ATP消耗和心肌收縮功能抑制，導(dǎo)致心肌血流變發(fā)現(xiàn)顯著改變。糖酵解是在厭氧或有氧條件下將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸或丙酮酸鹽的生化過程，其凈產(chǎn)量為2摩爾的ATP。在缺血期間，糖酵解因其產(chǎn)生ATP的能力而成為一種非常重要的能量來源[9-10]。

五味子乙素是從五味子果實(shí)中分離出的活性單體，其在臨床上被應(yīng)用于治療肝炎和缺血性疾病，如心肌缺血和腦缺血。近年來的研究進(jìn)一步表明，五味子乙素可通過下調(diào)炎癥細(xì)胞因子、激活eNOS通路、抑制細(xì)胞凋亡、抑制心肌缺血再灌注等途徑，改善心肌功能，減輕心肌重塑[11-12]。此外研究表明五味子乙素對(duì)心肌缺血/再灌注(I/R)損傷具有一定保護(hù)作用，并且在體內(nèi)和體外模型中具有很強(qiáng)的抗炎性能。研究還表明，在體外模型中，五味子乙素可以通過ATR抑制特異性地抑制p53的磷酸化[13-14]。但五味子乙素對(duì)缺血再灌注心肌損傷的能量代謝調(diào)節(jié)作用尚未見報(bào)道，因此在本研究中我們采用離體心肌缺血再灌注模型考察五味子乙素對(duì)其的影響，研究結(jié)果表明，五味子乙素可以顯著改善心肌血流變相關(guān)指標(biāo)，顯著升高左室發(fā)展壓、左室內(nèi)壓上升/ 下降速率和恢復(fù)心肌心率。同時(shí)通過檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)及線粒體線粒體相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果表明五味子乙素可以顯著抑制心肌氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)減少心肌線粒體損傷的發(fā)生，通過檢測(cè)心肌ATP及乳酸生成含量表明，五味子乙素可以顯著升高心肌ATP及乳酸含量，恢復(fù)心肌能量代謝。當(dāng)將五味子乙素與糖酵解抑制劑Lonidamine聯(lián)合使用后，五味子乙素對(duì)心肌的改善作用顯著降低，且對(duì)心肌能量代謝的調(diào)節(jié)作用顯著降低。心肌缺血再灌注損傷發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，糖酵解是在機(jī)體無氧環(huán)境下是機(jī)體功能的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[15]，五味子乙素可通過調(diào)節(jié)心肌糖酵解反應(yīng)，改善缺血再灌注損傷是發(fā)生，但其調(diào)節(jié)心肌糖酵解反應(yīng)的機(jī)制還有待探究。