抗氧化劑防治老年性聾的研究進展

歐陽朝明 董楊

(上海中醫藥大學 1教學實驗中心，上海 201203;2基礎醫學院)

衰老是一種普遍的生理現象，以生物體時間依賴的功能衰退為特征〔1〕。此過程常伴隨著與年齡相關的聽力損失，也稱老年性聾。老年性聾是老年人中最常見的感覺障礙，調查顯示，在65歲以上的人群中，老年性聾的發病率為25%～40%，大于75歲的老年人中，其發病率為48%～66%，而85歲以上的老年人發病率則超過80%〔2〕。老年性聾還會導致社交孤獨、抑郁和認知能力障礙等疾病。據2016年的全球疾病負擔(GBD)報告顯示，聽力喪失已成為致殘年數(YLDs)的第三大原因，也是全球健康的一個重要問題，特別是在老年人口中〔3〕。

1 老年性聾的氧化應激發病機制

到目前為止，老年性聾的發病機制尚不十分清楚。氧化應激造成的損傷是目前比較公認的老年性聾發病機制之一。生理狀態下，活性氧(ROS)作為細胞信號轉導和細胞周期調節的氧化還原反應信使發揮功能，可以被內源性的抗氧化機制代謝和清除。氧化應激是指ROS生成和生物體抗氧化損傷能力的失衡。耳蝸中的ROS主要來源于線粒體，線粒體DNA(mtDNA)對于ROS造成的損傷尤為敏感，一個原因是mtDNA位置與ROS產生的位置相近，另一個原因是，與核DNA相比，mtDNA損傷修復的能力更為有限〔4〕。Falah等〔5〕對老年性聾患者的mtDNA控制區4種核苷酸變異頻率進行研究，共有58例老年性聾患者和220例對照者參加了這項研究，采用聚合酶鏈反應和Sanger測序法研究mtDNA控制區的遺傳變異，研究結果顯示，老年性聾患者mtDNA控制區的4種核苷酸變異頻率與對照組比較差異有統計學意義，進一步支持了線粒體在老年性聾發展過程中細胞內機制中具有重要作用，這些變異有可能成為老年性聾發生高風險的診斷標記。Du等〔6〕研究發現，在注射D-半乳糖8 w的擬老化SD大鼠模型中，耳蝸mtDNA普遍缺失和線粒體超微結構損傷增加，耳蝸中NADPH氧化酶(NOX)3、8-羥基-2-脫氧鳥苷(8-OHdG)、NADP氧化酶亞單位(P22phox)、活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-Caspase)3表達及脫氧核苷酸末端轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法(TUNEL)陽性細胞數均高于對照組，表明一氧化氮合酶NOX3介導的氧化應激促進了mtDNA突變的聚集，激活Caspase3依賴性細胞凋亡信號通路促進耳蝸老化過程細胞死亡。除了外周改變外，有研究者對聽覺中樞聽皮層進行研究發現，伴隨年齡增長的核因子E2相關因子(Nrf2)信號通路活性降低及相關的mtDNA損傷，是老年性聾聽皮層老化的主要機制之一〔7〕。正常情況下，線粒體產生的ROS易為內源性抗氧化劑代謝清除，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)或其他相關的酶，以維持內耳的動態平衡，而衰老過程打破了這種穩態。近期，有研究報道從細胞水平和整體水平研究ROS介導的DNA損傷應答是否推動了耳蝸毛細胞的老化，結果顯示，過氧化氫(H2O2)暴露可以使耳蝸毛細胞磷酸化組蛋白H2AX(γH2AX)和P53結合蛋白(53BP1)的表達增加，啟動 DNA損傷應答，而合成的SOD/CAT模擬物含錳氧化應激抑制物(EUK-207)在體外可減輕H2O2誘導的耳蝸細胞DNA損傷和衰老表型，在體內可減緩快速老化小鼠模型(SAMP8)小鼠年齡相關的聽力損失和耳蝸毛細胞退化，綜上得出結論，ROS誘導的DNA損傷應答推動了耳蝸毛細胞的衰老，可以加快老年性聾的發生發展〔8〕。

2 抗氧化劑與老年性聾

在老年性聾中，毛細胞或螺旋神經節神經元一旦損失，會導致聽閾升高，不能再恢復到正常水平，因為這兩類細胞在哺乳動物中都是不可再生的。因此，預防和延緩是老年性聾的重要干預手段?？寡趸瘎┦悄壳胺乐卫夏晷悦@研究較多的一類藥物，主要通過降低氧化應激造成的損傷來延緩老年性聾的發生〔9，10〕。抗氧化劑分為直接抗氧化劑和間接抗氧化劑，直接抗氧化劑比如輔酶(Co)Q10和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)，可以直接跟ROS反應降低氧化應激；間接抗氧化劑，比如酚類化合物和營養物質，可以激活細胞氧化還原酶〔11〕。

2.1直接抗氧化劑 NAC具有很強的清除ROS的能力，還能上調還原型谷胱甘肽和谷胱甘肽過氧化物酶(GXH-Px)，并通過防止脂質過氧化而抑制ROS的產生。在Ding等〔12〕的研究中，采用Ggt1基因核苷酸缺失突變(Ggt1dwg/dwg)轉基因小鼠，該小鼠體現為γ谷?；D移酶1基因功能突變，而這個基因主要編碼一種對于GSH合成有重要作用的抗氧化酶。結果顯示，用Ggt1dwg/dwg轉基因小鼠體現了年齡相關的聽力損失和病理改變，是老年性聾的理想模型，NAC能減輕Ggt1dwg/dwg轉基因小鼠的年齡相關性聽力損失和內毛細胞損失，認為NAC具有延緩老年性聾的作用。還有研究在SAMP8老化小鼠上觀察到，NAC可以延緩伴隨老化的聽力損失，對耳蝸毛細胞有保護作用〔13〕。Tan等〔14〕采用線粒體蛋白抑癌基因(FUS1)的基因敲除(FUS1 KO)小鼠，作為代謝型老年性聾小鼠模型，研究結果發現，在出現嚴重聽力喪失之前，3月齡FUS1 KO小鼠耳蝸的抗氧化、營養物質和能量感知通路就已經發生病理改變，4～5月齡的FUS1 KO小鼠即出現耳蝸內電位(EP)的下降，認為可能是由于小鼠耳蝸血管紋中嚴重的線粒體和血管病變所致。短期給予抗氧化劑NAC治療可以糾正這些病理分子變化，而長期給予NAC可以恢復EP，改善聽性腦干反應(ABR)聽閾值，修復線粒體結構，進而延緩老年性聾小鼠的聽力損失。

維生素C是一種重要的親水性抗氧化劑和脂質過氧化抑制劑，與老年性聾的發生有密切關系。Kang等〔15〕基于韓國國民健康與營養調查的數據，通過對1 910位參與者的數據進行單變量和多元線性回歸分析得出結論，飲食中攝入維生素C與老年人聽力改善顯著相關，而只有不到一半的老年人獲取了足量的維生素，隨著年齡增加，維生素攝入會減少，因此認為補充合適的維生素有利于抑制老年人的聽力下降。老年性聾是多種原因造成的復雜疾病，單一干預手段可能不能達到良好的治療效果，兩種或以上治療手段聯合，比如抗氧化劑與耳蝸血管擴張劑聯合使用有可能達到更好的治療效果〔16〕。Alvarado等〔17〕給3月齡Wistar大鼠服用自由基清除劑維生素A、C、E和耳蝸血管擴張藥鎂離子(Mg2+)的聯合制劑，在6～8月齡和12～14月齡進行聽功能檢測，結果顯示，給藥組聽閾值明顯低于對照組，表明該聯合制劑可以延緩年齡相關的聽功能損傷，對老年性聾有輔助的治療作用。CoQ10是一種存在于自然界的脂溶性醌類化合物，其結構與維生素K、維生素E相似，是作用較強的脂溶性抗氧化劑。有臨床試驗觀察到，口服水溶性CoQ10可以改善老年性聾患者的聽力損失〔18〕。Someya等〔19〕的研究發現，C57BL/6J小鼠口服CoQ10和α-硫辛酸均可以抑制耳蝸Bak基因表達，降低耳蝸細胞損傷，延緩老年性聾。α-硫辛酸是一種兼具水溶性和脂溶性的抗氧化劑，是一種類似維生素的物質。Ahn等〔20〕研究發現，α-硫辛酸可以抑制近交系(DBA)小鼠早發性的聽力損失。

動物實驗研究發現，口服六種抗氧化劑L-半胱氨酸-谷胱甘肽(L-CySSG)、核糖半胱氨酸、NW-硝基-L-精氨酸甲酯(LNAME)、維生素B12、葉酸和維生素C的混合溶液，可以明顯改善C57BL/6小鼠年齡相關的聽力損失。其中，L-CySSG是L-半胱氨酸和GSH的混合物，抗ROS非常有效；而核糖半胱氨酸是半胱氨酸前體藥物，半胱氨酸又是GSH生物合成中的關鍵成分；LNAME是NOS抑制劑，因此它能減慢或阻止耳蝸內一氧化氮(NO)的產生及其隨后的損害作用；維生素B12和葉酸在DNA合成和修復中至關重要〔21〕。

2.2間接抗氧化劑 Sanz-Fernandez等〔22〕選用了6種多酚類化合物單寧酸、白藜蘆醇、槲皮素，蕓香苷，沒食子酸和桑色素混合在一起，觀察其對大鼠年齡相關聽力損失的作用，發現該多酚類混合物可以明顯改善大鼠多頻穩態聽覺誘發反應(ASSR)和ABR的聽閾值，有延緩老年性聾的作用。Sánchez-Rodríguez等〔23〕的研究也發現，該多酚混合物可以減低老年大鼠升高的ROS水平，改善老年大鼠的SOD與GSH-Px的活性，顯著改善ASSR閾值。該多酚混合物還可以降低老年大鼠耳蝸DNA氧化損傷標志物8-OHdG水平和三磷酸腺苷(ATP)水平，下調凋亡相關蛋白Caspase-3/9的表達，認為多酚可以降低老年大鼠耳蝸的氧化應激水平，抑制細胞凋亡，從而達到延緩老年性聾的作用〔24〕。

3 具有抗氧化作用的中藥與老年性聾

中藥中有許多具有抗氧化作用的成分，是巨大的天然抗氧化劑寶庫。Tanigawa等〔25〕研究發現，大豆中的大豆β-伴球蛋白(β-Conglycinin)可以提高耳蝸血流，提高血管紋中的內源一氧化氮合酶的表達，緩解氧化損傷，降低血管紋中邊緣細胞的脂褐素顆粒和微血管周細胞空泡變性；β-伴球蛋白還能減輕耳蝸螺旋神經節細胞損失，降低脂褐素顆粒、核內侵、髓鞘空泡化的頻率。綜上，認為β-伴球蛋白主要通過維持耳蝸血管血流和抑制氧化應激來改善老年性聾。銀杏葉提取物EGb761作為一種ROS清除劑，它能防止脂質過氧化、提高GSH含量及GSH還原酶的活性。Nevado等〔26〕的研究顯示，EGb761可以改善12月齡SD大鼠的ASSR，下調促凋亡相關蛋白Caspase-3和Caspase-7的表達。Liu等〔27〕研究發現，石榴皮提取物能通過調節蛋白磷酸酶1核靶向亞單位/蛋白磷酸酶1(PNUTS/PP1)信號通路降低氧化應激對耳蝸的損傷，從而減緩了D-半乳糖誘導的老年性聽力損失，具有防治老年性聾的作用。白藜蘆醇是一種多酚二苯乙烯類物質，存在于葡萄、桑樹、花生、朝鮮槐等多種植物中，在中藥土茯苓、虎杖、何首烏、三七、厚樸中也有一定含量，有研究表明，白藜蘆醇能顯著地抑制miR-34a過表達及H2O2氧化損傷導致的耳蝸毛細胞株HEI-OC1死亡，用之喂養C57BL/6J小鼠兩個月后，顯著降低了小鼠的聽閾值和耳蝸毛細胞的丟失〔28〕。Du等〔29〕研究發現，羅布麻寧可以抑制D-半乳糖導致衰老模型大鼠蝸腹側核的NOX活性、H2O2水平、mtDNA共同缺失和8-OHdG表達，并提高總SOD(T-SOD)和GSH-Px的活性；羅布麻寧還可以減輕D-半乳糖的衰老模型大鼠蝸腹側核線粒體超微結構損傷，促進ATP產生，提高線粒體膜電位水平，抑制細胞色素C從線粒體進入細胞質及Caspase 3依賴的細胞凋亡。

綜上所述，由于毛細胞不具有再生能力，預防和延緩老年性聾是主要策略。研究者在老年性聾的動物模型上觀察到許多抗氧化劑體現了延緩年齡相關性聽力損失的作用，是潛在的抗老年性聾藥物，但大多缺乏進一步的藥學相關研究，臨床研究也較少，離臨床應用尚有很長的距離。由于氧化應激無疑是老年性聾等衰老相關疾病的重要發病機制之一，因此抗氧化劑仍然是目前防治老年性聾一類潛在藥物，值得深入探討和研究。更值得注意的是，抗氧化劑除了常見的化合物外，中藥也是一個巨大的資源寶庫，其種類繁多，尚有許多我們不清楚的抗氧化成分。因此，應借助中藥基礎理論的指導，以中藥現代化研究手段的進步為依托，努力探索發掘提取其中的有效成分。另外，還可對現有抗氧化劑進行結構修飾等提高藥效，也是研究抗氧化劑防治老年性聾的重要思路。