甾體衍生物羥基化的生物轉化研究進展

蘇海林(云南經濟管理學院醫學院藥學系，云南 昆明 650200)

0 引言

近幾年來，人們對于甾體化合物的研究越來越廣泛，由于甾體化合物本身的特性使其在多方面均得到了應用，例如在治療淋巴母細胞白血病，治療內分泌紊亂等相關疾病以及進行人體器官移植時等均取得了較好的治療進展。目前甾體類激素已經成為除抗生素外的第二大類藥物，在醫療領域發揮著重要的作用。隨著人們對甾體化合物的相繼研究，甾體衍生物羥基化的生物轉化也受到了大家的廣泛關注，甾體衍生物羥基化的生物轉化使得最終產生了更多高效的中間或者終末產物，且甾體衍生物的生物轉化具有諸多優點，例如轉化過程中涉及的程序少，轉化周期短，轉化后副產物較少而有用的產物的收率較高，且具有專一化和快速精準的優點，此外還具有安全無公害，始終堅持綠色原則，該轉化方法是目前生物合成甾體類相關藥物的主要途徑[1]。

1 生物轉化

生物轉化(Biotransformation)又稱為生物催化，是指某類物質經過多種酶的催化作用而進行的代謝轉化，而外源物是需要轉化的對象，生物轉化的實質是使外源化合物利用生物體系本身具有的酶而進行的酶促催化反應，目前主要的酶促反應主要有氧化還原反應、羥基化反應、脫氫脫羧、酯化?；龋鄶得复俜磻枰跍睾偷沫h境中進行，進行生物轉化的重要原因之一就是為了維持機體內環境的穩態[2]。生物轉化與傳統的有機溶劑相比，主要具有以下幾方面優點：首先是為整個催化體系提供了區別于于傳統分子溶劑的反應環境，該環境能夠有效改善相關酶或細胞的活性，從而進一步提高了反應速率和產率。生物轉化具有高選擇性、作用溫和等特點，其中主要的生物催化方法包括全細胞生物催化轉化法、固定化細胞催化轉化法以及靜態細胞生物催化轉化法。依據底物來源不同又可以將轉化法分為植物轉化動物轉化法以及微生物轉化法等。

在所有的生物轉化中，微生物轉化是比較常見的一種，微生物轉化又稱為微生物酶法轉化，是指微生物利用自身代謝功能而進行一系列的有機反應，微生物轉化過程中所需要的酶促生物催化劑來源于微生物細胞，該過程具有快速準確，操作便捷以及區域和空間感選擇性較強、成本低等優點。因為微生物轉化能夠合成一些自然界不具有的中間產物，或者經過化學合成法無法合成的藥物，使得該方法受到廣大微生物學者、有機化學學者以及藥學學者的青睞。我國著名藥學家屠呦呦老師從中藥青蒿中提取到了青蒿素，青蒿素是一類繼氯喹、乙氨嘧啶和伯喹等藥物后用來治療瘧疾的比較有效的藥物，同時青蒿素具有較低的毒性，青蒿素被世界衛生組織稱為“世界上唯一有效的瘧疾治療藥物”，為治療瘧疾作出了重大貢獻。

2 甾體衍生物羥化反應

2.1 甾體衍生物羥化反應原理

甾體化合物本身屬于小分子化合物且具有脂溶性大的特點，較好的脂溶性使其易于進出細胞，當甾體化合物進入細胞后，會在細胞內發生一系列的生理變化反應，由于其自身結構和功能的特點而使甾體化合物成為較好的藥物分子[3]。例如在臨床上，甾體化合物中的腎上腺皮質激素可以用來作為治療支氣管哮喘、類風濕性關節炎等疾病的良好藥物。另外，甾體化合物中的激素還可以起到較好的生理保健功能，例如可以有效改善機體肥胖、增強體力以及改善機體蛋白質等代謝等作用。甾體化合物的原料主要來自于植物的甾醇，例如油菜的甾醇、β-谷甾醇以及豆甾醇等，而這些甾醇主要來源于豆類植物，而另一類甾體化合物主要是指存在于一些真菌體內的麥角甾醇，在黃體酮等藥物的生產過程中比較常見，目前在分枝桿菌體內也發現了甾醇的分布。同位素示蹤實驗結果顯示甾體衍生物的羥基化反應是基于甾體上的羥基直接將甾體碳架上的氫原子的位置取代，且在取代過程中未發生空間構型的改變，且羥基轉化過程中的氧不僅由水中的氫氧基提供，而且空氣中的氧也為其提供氧原子，也就是說當使用某些霉菌轉化甾體時需要有足夠的氧供給，從而保證羥基化過程對氧的需求。此外，甾體化合物進行羥基化反應時其羥基上的氫會被直接取代。

2.2 底物溶解率的影響

在對甾體化合物實施轉化的過程中，由于甾體本身具有較差的溶解性，且在整個轉化過程中會出現較多的副產物，另外，菌體的轉化能力以及甾體底物的轉化效率低等原因，已經成為目前生物轉化技術的一大問題。由于原料溶解性的問題對甾體化合物的生物轉化的影響較大，所以目前尋找新的甾體藥物仍然是當下及未來需要重點關注的研究方向[4]。

2.3 甾體羥基酶

甾體羥基酶是一種誘導酶，主要存在于無細胞抽提液離心后得到的含有線粒體的上清液中，對該上清液進行分離和純化可知，該上清液中還存在離心后分離出的微粒體，微粒體在通常條件下不進行羥化反應，而只有當微粒體和高碘酸鈉結合后才具有羥基化酶。

3 甾體衍生物羥基化的生物轉化研究現狀

3.1 靜息細胞生物催化轉化法

靜息細胞生物催化轉化是通過制備出靜態時的菌體懸浮液來進一步實施生物催化。首先取對數期生長的菌體，過濾并離心，收集菌體沉淀，再將菌體懸浮于合適的緩沖溶液中，最后再加入相應的底物來進行生物轉化[5]。使用該方法制備的產物具有雜質少、易于分離純化以及反應后的菌體可以重復利用等優點。相關研究員發現利用新金分枝桿菌生長狀態時的細胞以及靜息狀態時的細胞作為轉化體系，而只有靜息狀態下的細胞才能夠使甾醇實現正常轉化，且得到的產物不容易降解。

3.2 全細胞生物催化轉化法

全細胞生物催化轉化在甾體衍生物的工業生產中發揮著重要的價值。用來實施催化的酶通常分布在膜蛋白上，例外，在催化過程中還需要一些輔酶的參與，與傳統的酶反應相比，全細胞生物催化轉化具有步驟簡單、成本低等優點，而且全細胞生物轉化過程中不需要輔酶的參與，該項也使得轉化成本大大降低。目前也已經發現了許多植物、動物以及微生物(細菌、真菌等)能夠實現對甾體化合物的轉化，其中真菌的應用最為廣泛，被廣泛用來對甾體藥物進行轉化，而且相關研究也報道稱，真菌對甾體化合物進行轉化時絕大部分進行的是甾體衍生物羥基化的生物轉化過程。

3.3 固定化細胞生物催化轉化法

甾體化合物具有較強的疏水性以及受到底物傳質的制約，使得生物轉化效率受到了影響，針對這一問題許多研究者通過研究磁場、表面活性劑以及超聲波等來增強細胞膜的通透性，從而進一步增強底物的溶解。

固定化細胞生物催化轉化技術在對甾體化合物進行轉化時幾乎已經實現了甾體藥物的半連續化生產，該項技術不僅能有效增加菌體溶液的濃度，同時菌體也可以重復利用[6]。通常在對菌體進行培養時，隨著培養時間的延長，菌體可能會發生自溶現象，而采取固定化細胞轉化法有望解決該弊端，使得菌體保持開始的狀態。固定化細胞轉化法主要包括底物包埋和交聯、載體介質的吸附以及共價結合等主要步驟，此外，固定化細胞應用于載體化合物羥基的生物轉化中時的催化效率主要取決于載體本身的性質特點，其次反應條件的設置會對菌體細胞活性產生一定的影響。目前常用的固定化甾體有海藻酸鹽凝膠、聚乙烯醇、葡聚糖凝膠以及聚丙烯酰胺凝膠等，在實際操作中將收集到的菌體固定到聚丙烯酰胺凝膠中可以重復多次地催化底物發生羥基化反應，從而在最大程度上提高固定效率和產率。

4 結語

文章重點闡述了生物轉化相關應用以及甾體衍生物羥基化的生物轉化原理，此外進一步闡明了甾體衍生物羥基化生物轉化的研究方向和進展。

隨著生物技術的不斷發展，最主要的是微生物技術的應用，甾體衍生物的轉化已經不只是局限于轉化效率和轉化的專一性，而更加注重的是轉化的途徑和過程，安全高效的轉化過程是大家迫切追求的結果，許多科學家利用分子生物學、合成生物學等多種生物方法和策略來優化甾體類藥物的合成過程。甾體衍生物尤其是作為藥物的甾體化合物通常均具有較高的藥理活性，甾體衍生物羥基化轉化能否取得較高的產率一直都是制備的難題，而如何有效地提高底物濃度，即在轉化過程中擁有更多有利的產物，構建并選擇有效的生物轉化介質，同時解決底物疏水性等問題，對提高底物濃度，增加產率具有重要意義。因此現階段需要尋找更加普適的轉化體系，構建新型綠色的生物轉化體系是目前亟待解決的問題，新型“綠色溶劑”成為大家迫切關注的問題。

綜上所述，在對甾體衍生物羥基化進行生物轉化時仍然需要我們依據現有的理論知識和現有的實踐經驗而不斷去探索，去選擇新的途徑，依據前人的科學研究經驗，總結并歸納相關轉化體系和技術，對其進行深入細致的研究，雖然距產物大規模工業化尚有一定的距離，但是應用前景廣闊。