Luminal型乳腺癌中PD-L1的表達特點及預測價值

郝語晨 畢愷欣 劉曉青 徐毅 陶新楠 張亞芬山西醫科大學（太原030000）；山西醫科大學附屬人民醫院（太原0300）

國際癌癥研究中心發布的2018年全球癌癥統計報告顯示乳腺癌居于全球女性癌癥發病率首位，而我國人口基數龐大是不容忽視的乳腺癌大國［1］。根據世界癌癥生存研究CONCORD發布的最新數據，我國乳腺癌年齡標化生存率為83.2%，比澳大利亞、美國等西方發達國家的同期數據落后6%左右［2］，延長生存時間、降低病死率是我國乳腺癌疾病管理的重點。PD-1/PD-L1檢查點（programmed cell death-1/programmed death ligand-1 checkpoint）及其抑制劑是最近幾年腫瘤免疫學中備受矚目的研究熱點［3-4］，其理論基礎是腫瘤的免疫逃逸機制：正常生理條件下，人體免疫系統存在促進自我耐受防止自身免疫的機制，即T細胞被激活時其表面PD-1表達增加，而攻擊性炎癥因子IFN-γ、TNF-α等刺激特異性免疫細胞表達其配體PD-L1和PD-L2，其中主要為PD-L1，當PD-1與其配體PD-L1結合時，經過一系列酶聯反應抑制下游的PI3K/AKt/mTOR通路，進而抑制T細胞功能，而腫瘤細胞恰恰習得這種逃避免疫攻擊的方法，在其細胞表面大量表達PD-L1，實現免疫逃逸，參與腫瘤增殖、侵襲、轉移等惡性生物學行為［5-6］。

腫瘤組織中腫瘤細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs）均有PD-L1表達［5-6］，本研究關注PD-L1在上述兩類細胞的表達特點，分別探索對生存預后有無預測價值。PD-L1在三陰性、Her-2過表達型乳腺癌的預后預測價值已被大量研究［7-13］證實，即PD-L1表達越多，提示預后越差。然而三陰性、Her-2過表達型并非最常見亞型，僅占乳腺癌總體的不到30%，上述研究發現的普適意義有限，因此筆者認為，進一步研究最常見亞型（即Luminal型）對臨床的預后預測和治療指導意義更大。為避免Her-2陽性患者赫賽汀治療不規范影響預后分析，本研究僅納入Luminal（Her-2陰性）型病例。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究為歷史前瞻性研究。本研究入組2013年1-12月于山西省人民醫院乳腺外科住院治療的乳腺浸潤性導管癌病例。納入標準：（1）女性；（2）乳腺癌分期較早可行規范手術治療者；（3）病理類型為浸潤性導管癌；（4）分子類型為Luminal（Her-2陰性）型；（5）相關病例資料完善。排除標準：（1）本次診斷為雙側乳腺癌；（2）既往或本次治療期間有乳腺或其他原發惡性腫瘤病史；（3）因患者無法承受或患者意愿等行姑息性手術者；（4）內分泌治療不規范。

1.2 方法

1.2.1 臨床數據年齡（以身份證出生年月為準）；月經狀態（絕經定義為雙側卵巢切除術后/年齡≥60歲/年齡＜60歲，自然停經≥12個月/FSH和雌二醇處于絕經后范圍）；乳腺/婦科合并癥（定義為乳腺纖維瘤、乳管內乳頭狀瘤/子宮肌瘤、卵巢囊腫等與雌性激素紊亂相關的乳腺/婦科良性疾病）；家族史（定義為直系親屬有惡性腫瘤病史）。

1.2.2 病理數據病理學分級、ER%、PR%、TIL%、Ki-67、TNM分期（依據AJCC第九版，記為Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期）、分子分型［將Luminal型分為Luminal A型，即ER和/或PR陽性、Ki-67＜14%且Her2陰性；Luminal B（Her2-），即ER和（或）PR陽性、Ki-67≥14%且Her2陰性］。

1.2.3 治療情況手術時間及方式、術后輔助治療類型、具體藥物方案。

1.3 免疫組化本研究采用免疫組化二步法。PD-L1抗體試劑選用中山金橋兔單克隆一抗，克隆號為SP142。PD-L1在腫瘤細胞膜和/或細胞質表達記為TC（tumor-cell），在TILs表達記為IC（immuno-cell），采用David E等的評分方法［14］，即計算PD-L1表達細胞在腫瘤區域的占比，以百分比表示（即TC%/IC%）；選取1%、5%、10%為截點，即＜1%記為TC/IC0分，≥1%且＜5%記為TC/IC1分，≥5%且＜10%記為TC/IC2分，≥10%記為TC/IC3分。TC和IC的cut-off值均為1，即0分為陰性表達，1、2、3分為陽性表達。

查閱病理報告并記錄病理學分級，調取原始H&E切片判讀ER%、PR%、Her-2±FISH、Ki-67、TIL%。ER、PR判讀參照我國《乳腺癌雌、孕激素免疫組織化學檢測指南（2015版）》。Her-2判讀采用2017年ASCO-CAP會議發布的最新指南［15］。TILs%判讀根據國際TILs工作組2015年版的推薦進行［16］。閱片結果由高年資病理科醫師審核確認。

ER%、PR%、Ki-67采用SOFT&TEXT試驗［17］的截點進行分層，即：ER%分層為＜50、≥50；PR%分層為＜20、20～ 49、≥ 50；Ki-67分層為＜14、14～ 19、20～25、≥26。病理學分級分為1/2/3級。TIL%選取30%、60%為截點，即＜30%記為TIL（1+），≥30%且＜60%記為TIL（2+），≥60%記為TIL（3+）。

1.4 隨訪通過電話、門診等方式隨訪患者院外內分泌治療情況及生存情況。生存事件定義為與乳腺癌疾病進展相關的死亡。隨訪時間為開始內分泌治療到內分泌治療滿5年。計算總生存期（overall survival，OS）。

1.5 統計學方法使用SPSS 25.0進行分析，計量資料以均數±標準差表示，對其進行正態性檢驗，符合正態性分布者進行獨立樣本t檢驗，不符合正態性分布者進行秩和檢驗。計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗。運用Cox生存分析判斷復發和生存預后的獨立因素。運用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較使用Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料本研究共納入225例Luminal型乳腺浸潤性導管癌患者，年齡21～78歲，平均（51.17±11.32）歲，中位年齡50歲；左乳癌109例，右乳癌117例。5年生存率為88.9%（200/225）。OS事件23例；刪失19例，其中16例失訪，3例死于其他疾病。

2.2 腫瘤組織中PD-L1表達特點PD-L1在腫瘤細胞和TILs均有表達，見圖1。225個樣本中有86（38.2%）個樣本的腫瘤細胞PD-L1陽性表達，24（10.7%）個樣本的TILs PD-L1陽性表達。納入指標的賦值見表1。

圖1 PD-L1在乳腺癌組織的表達Fig.1 PD-L1 expression in breast cancer tissue

表1 相關因素賦值說明Tab.1 Related factors and assignment instructions

2.2.1 PD-L1的表達與臨床指標的關系對年齡、月經狀態、合并癥、家族史、分期分析顯示：腫瘤細胞和TILs中PD-L1的表達僅在不同分期時差異具有統計學意義，見表2。

2.2.2 PD-L1的表達與病理指標的關系對ER%、PR%、Her2狀態、TIL評分、Ki-67、分子分型統計學分析顯示，不同PR%、TIL評分、Ki-67、分子分型的PD-L1在腫瘤細胞和TILs的表達差異具有統計學意義（P＜0.01），另外ER%（P=0.046）也是TILs中PD-L1表達的影響因素，見表3。

2.3 Cox回歸分析計算生存狀態的危險因素，由結果可見，IC評分（RR=2.375，P＜0.01）、PR（RR=0.926，P＜0.01）、Ki-67（RR=1.026，P=0.01）和病理學分級（RR=4.137，P＜0.01）是生存的獨立危險因素，而TC評分在單因素分析時有意義，多因素分析時差異無統計學意義，說明其受其他混雜因素影響，不能獨立影響生存預后。見表4。

表2 PD-L1表達與臨床指標的關系Tab.2 Relationship between PD-L1 expression and clinical indicators 例（%）

表3 PD-L1表達與病理指標的關系Tab.3 Relationship between PD-L1 expression and pathological indicators 例（%）

表4 生存狀態的危險因素分析Tab.4 Risk factor analysis of survival status

2.4 生存情況的比較對生存情況分析發現，IC陽性組患者生存率為37.5%（9/24），低于IC陰性組患者生存率96.0%（193/201），差異具有統計學意義（χ2=117.7，P＜0.001）。生存曲線見圖2。

3 討論

圖2 IC陰性組（n=201）和陽性組（n=24）（TILs中PD-L1表達陰性/陽性）的生存曲線Fig.2 Survival curves of IC negative group（n=201）and positive group（n=24）（negative/positive PD-L1 expression in TILs）

既往研究［7，12，18-19］報道 PD-L1 在 Luminal型乳腺癌細胞的陽性率為14.8%～53.1%，本研究中PD-L1在腫瘤細胞陽性率為38.2%，與上述報道基本一致。之前的研究［12，18，20］僅統計腫瘤細胞中PD-L1的表達，或不區分腫瘤細胞和TILs，籠統地記為腫瘤組織的表達［21］，據筆者所知，大部分學者沒有關注PD-L1在TILs的表達并作為一個獨立指標進行研究，因而其陽性率鮮有報道。筆者認為腫瘤微環境的主要有形成分為腫瘤細胞和TILs，綜合考慮兩者的PD-L1表達情況不僅能反映腫瘤的免疫逃逸能力，而且能夠研究免疫系統的應答狀態，與單獨研究腫瘤細胞相比更為嚴謹科學。目前腫瘤細胞陽性表達的判讀標準不盡相同，有的研究［7，21］僅認可細胞膜的著色，而有的研究［10，12，18，22］將細胞膜和/或細胞質的著色均判定為陽性表達，因此相關研究結果可比性較低，難以匯總分析形成大數據支持的結論，亟待統一公認的判讀標準。

本研究發現：PD-L1表達水平與病理學分級、ER、PR、Ki-67、分期顯著相關，PD-L1陽性組織較陰性組織病理學分級較高、ER%較低、PR%較低、TIL評分較高、Ki-67較高、分期較晚，Luminal B（Her2-）型陽性率顯著高于Luminal A型，換言之，無論腫瘤組織或TILs中，PD-L1陽性均提示腫瘤惡性程度較高，預后預期較差，這一結論可用腫瘤免疫逃逸來解釋。

單因素和多因素生存分析均顯示TIL不是生存的影響因素，與其他研究［8，23-24］的發現一致。而χ2檢驗提示不同TILs評分組織的PD-L1表達顯著不同，TILs中PD-L1的表達是死亡的獨立危險因素，因此筆者推測結合TILs和PD-L1能夠提供預后預測的額外信息。本研究發現TILs中PD-L1表達是生存的獨立危險因素，腫瘤細胞的PD-L1表達僅在單因素生存分析時是獨立危險因素，而Luminal A型和Luminal B Her2-型的PD-L1在腫瘤細胞和TILs的表達情況差異具有統計學意義，因此筆者考慮該結論與入組人群中Luminal A型和Luminal B Her2-型相對比例有關，后續研究將對Luminal型進一步細化分析。

PR狀態、Ki-67和病理學分級是公認的預后預測因素。PAN等［25］對EBCTCG數據庫中500 692例激素受體陽性早期乳癌患者內分泌治療5年后20年隨訪研究發現，淋巴結狀態在任意時間段都是強預測因子，組織學分級和Ki-67是最初5年預后的重要獨立預測因子，但在后續時間段僅具有中等預測效力。ORUCEVIC等［26］根據TAILORx研究的最新結果對復發預測風險評分檢驗，納入年齡、腫瘤大小、病理學分級、PR狀態和組織學類型分析發現病理學分級和PR狀態是5個臨床病理特征中復發風險評分高低的最強預測因素。本研究對納入人群隨訪5年，生存分析結果與上述研究相一致，由于Luminal型乳腺癌與其他亞型相比5年后仍有較高復發率，筆者將繼續隨訪以獲取各個時間段腫瘤浸潤淋巴細胞PD-L1表達預測意義的變化。

腫瘤細胞和免疫細胞都能激活PD-1/PD-L1檢查點，上調PD-L1的表達，負性調節抗腫瘤免疫反應［20］。目前研究較為透徹的機制主要為兩條信號通路的激活［27］：PI3K/AKt/mTOR激活介導的細胞內信號通路和IFNGRs/JAK/STAT激活介導的細胞外信號通路。CHEN等［28］報道IFNγ上調外泌體PD-L1表達水平，抑制免疫和促瘤生長；外泌體PD-L1水平變化能夠預測治療后腫瘤細胞對T細胞再活化的適應性反應水平。筆者認為，TILs和外泌體中的PD-L1水平都能反映腫瘤與免疫系統抗衡的結果，其變化規律是治療反應性的重要預測因子，對指導臨床工作具有重要意義，例如對于需要新輔助治療的晚期乳腺癌患者，穿刺獲取組織中PD-L1的表達情況，為患者初始治療時選擇的個體化治療方案，未來條件允許時，密切檢測血液中PD-L1水平變化，掌握免疫系統受壓制程度變化，及時調整用藥選擇。

綜上，PD-L1在TILs的表達對生存預后具有一定的預測價值，可為臨床醫師預后判斷及治療選擇提供一定指導。