乳腺癌中泛素蛋白連接酶E3A與泛素特異性蛋白酶25的表達及其臨床意義

榮欣欣 黃紅梅 李靜佳 侯令密 劉家有 李金穗 謝少利 楊懿 鄧世山川北醫學院解剖教研室（四川南充637000）；川北醫學院附屬醫院甲狀腺乳腺外科（四川南充637000）

乳腺癌是女性最常見的癌癥和死亡的主要原因。其中，中國乳腺癌死亡病例占全球的1/10，嚴重影響女性健康［1-2］。因而，尋找乳腺癌治療的靶點或者新的思路成為乳腺癌研究的熱點。人體蛋白質的降解途徑主要有兩種：溶酶體途徑和泛素-蛋白酶體途徑（UPP）。泛素-蛋白酶體系統由泛素、泛素活化酶（E1）、泛素連接酶（E2s）、泛素-蛋白連接酶（E3s）、26s蛋白酶體和去泛素化酶（DUBs）等組成。泛素蛋白連接酶E3A（ubiquitin protein ligase E3A，UBE3A）是泛素-蛋白連接酶（E3s）中的一員，主要作用是泛素化連接相關的靶蛋白，使其通過UPP途徑被降解。泛素特異性蛋白酶25（ubiquitin specific protease 25，USP25）是一種去泛素化酶，能夠去泛素化相關的底物蛋白，從而避免底物蛋白被UPP途徑降解。UBE3A與USP25均為泛素蛋白酶體系統中的組成成員，其中UBE3A與天使綜合征的關系密切［3-6］，而在乳腺癌中的研究較少；USP25在炎癥免疫反應中研究較多［7-9］，而在乳腺癌中的作用尚未見報道。DENG等［10］通過限制性片段差異顯示多聚酶鏈反應（RFDD-PCR）對泛素蛋白酶體組成部分進行研究發現，UBE3A與USP25在乳腺癌組織中均高表達（＞3倍），但未對其在乳腺癌中的作用和它們之間的關系作具體研究。本課題通過免疫組化染色觀察UBE3A與USP25在乳腺癌組織中的表達情況，并分析它們與乳腺癌臨床病理特征之間的關系，為乳腺癌的臨床研究及治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象所有乳腺組織標本來自川北醫學院附屬醫院甲狀腺乳腺外科2017-2018年手術切除的組織，包括癌組織與鄰近相對正常的組織，病理診斷均為浸潤性導管癌，并收集了相關的臨床、病理資料，共50例。患者年齡36～70歲，其中＜60歲41例，≥60歲9例。癌組織病理分化程度分級：WHOⅠ級13例，WHOⅡ級25例，WHOⅢ級12例；TNM分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期30例，Ⅲ期12例；有淋巴結轉移者的34例，無淋巴結轉移者16例。

1.1.2 實驗試劑乳腺癌細胞株MCF-7購至中國科學院細胞總庫，shRNA-UBE3A慢病毒委托上海吉凱基因化學有限公司合成。兔抗人USP25多克隆抗體（Abcam，美國），兔抗人UBE3A多克隆抗體（Abcam，美國），山羊抗兔IgG二抗（Proteintech，中國），UBE3A、USP25上下游引物（生工生物工程股份有限公司，中國），BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學發光超特敏試劑盒（碧云天，中國），SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa，日本）。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化及結果判斷免疫組化采用En-Vision法染色：65℃烤箱內烤片2 h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各脫蠟10 min，梯度酒精水化各3 min，流水沖洗5 min，枸櫞酸緩沖液抗原修復煮沸15 min，冷卻后PBS液洗3次×3 min，3%H2O2去離子水常溫10 min滅活內源性過氧化氫酶活性，PBS液洗3次×3 min，10%的羊血清37℃、封閉非特異性抗原10 min，滴加一抗4℃冰箱過夜，37℃恒溫箱復溫20 min，PBS液洗3次×3 min，滴加二抗37℃恒溫箱中孵育40 min，PBS液洗3次×3 min，按說明書配制DAB顯色液，DAB顯色，流水沖洗5 min，蘇木素復染3 min，流水沖洗5 min，1%鹽酸酒精分色10 s，流水沖洗5 min，梯度酒精脫水各3 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各透明10 min，中性快干膠封片，普通顯微鏡下觀察并進行拍照。PBS代替一抗作空白對照，癌旁組織染色作陰性對照。光鏡下觀察，UBE3A與USP25主要表達于乳腺癌細胞的細胞質，以細胞質呈現棕黃色顆粒為陽性。實驗結果采用半定量計分法進行分析［11］。陽性細胞率：≤5%為0分，＞5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分。染色強度：無顯色為0分，淺黃色為1分，中等棕黃色為2分，深棕黃色為3分。兩項指標得分的乘積作為判斷標準：0～4分為陰性（-），5～12分為陽性（+）。

1.2.2 細胞培養及慢病毒轉染MCF-7細胞用含15%胎牛血清的DMEM培養基于37℃、5%CO2恒溫培養箱內培養。慢病毒轉染按照吉凱基因說明書進行。

1.2.3 qRT-PCR按照試劑盒說明書提取RNA，逆轉錄成cDNA。在LightCycler PCR儀上進行PCR反應，設置反應條件：（1）預變性：95 ℃、30 s，1 cycle；（2）2步法PCR反應：95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40 cycle；（3）溶解：95 ℃、5 s，60 ℃、60 s，95 ℃、1 s，1 cycle；（4）降溫：50 ℃、30 s，1 cycle。

1.2.4 Western Blot檢測配置RIPA∶PMSF=100∶1的裂解液，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，轉膜，抗原抗體免疫反應，ECL超特敏化學發光試劑盒進行化學發光反應，熒光成像儀內曝光條帶。

1.3 統計學方法采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，計數資料用率表示，率的比較采用χ2檢驗；計量資料正態分布用均數±標準差表示，各組間均數比較采用方差分析，其中兩兩比較用LSD法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組織中UBE3A與USP25的表達UBE3A與USP25主要表達于乳腺癌細胞的細胞質（圖1）。50例乳腺癌組織，UBE3A在32例中表達陽性，陽性率64%（32/50），而在鄰近相對正常組織中為陰性表達，其差異具有統計學意義（χ2=47.059，P＜ 0.001）；USP25在36例乳腺癌組織中表達陽性，陽性率72%（36/50），而在鄰近相對正常組織中為陰性表達，其差異具有統計學意義（χ2=56.250，P＜ 0.001）。

圖1 UBE3A與USP25在乳腺癌及癌旁相對正常組織中的表達情況（EnVision法，200×）Fig.1 Expression of UBE3A and USP25 in breast cancer and adjacent normal tissues（EnVision method，200 ×）

2.2 UBE3A、USP25在乳腺癌組織中的表達與臨床病理特征之間的關系將UBE3A、USP25的表達情況與患者臨床病理特征間的關系進行分析（表1），在乳腺癌組織中，UBE3A與USP25的表達均與淋巴結轉移相關（P=0.001，P=0.041），其陽性率在有淋巴結轉移患者中明顯高于無淋巴結轉移者；UBE3A與USP25的表達均與Ki-67的表達相關（P＜0.001，P=0.029），且在Ki-67高表達組（Ki-67≥14%）陽性表達率遠遠高于Ki-67低表達組（Ki-67＜14%）。另外，USP25在乳腺癌組織中的表達與組織學分級（病理分化程度）相關（χ2=6.270，P=0.046），其陽性率隨著分化程度降低而逐漸升高。

2.3 UBE3A敲減結果驗證在乳腺癌MCF-7細胞中敲減UBE3A的表達，并檢測基因和蛋白的敲減水平（圖2、3）。在空白組、陰性對照組、敲減UBE3A組UBE3A mRNA的相對表達量分別為1、1.000 ± 0.024、0.345 ± 0.012（F=1 761.405，P＜0.001），UBE3A蛋白的相對表達量分別為0.877±0.034 、0.793 ± 0.071、0.374 ± 0.031（F=90.231，P＜0.001）。UBE3A mRNA在敲減UBE3A組的表達量為空白組的34.5%，敲減率65.5%，其差異具有統計學意義（P＜0.001）；UBE3A蛋白在敲減UBE3A組的表達量為空白組的42.5%，敲減率為57.5%，其差異具有統計學意義（P＜0.001）；兩者在陰性對照組與空白組的表達差異無統計學意義（P=0.974，P=0.079），實驗結果表明UBE3A的基因與蛋白被有效敲減。

圖2 Western Blot檢測UBE3A的敲減水平Fig.2 Knockdown level of UBE3A detected by Western Blot

圖3 UBE3A mRNA及蛋白的敲減水平Fig.3 Knockdown levels of UBE3A mRNA and protein

表1 UBE3A、USP25的表達與乳腺癌臨床病理特征之間的關系Tab.1 Relationship between UBE3A，USP25 and clinicopathological features of breast cancer

2.4 敲減UBE3A后觀察USP25 mRNA的表達水平在空白組、陰性對照組、敲減UBE3A組USP25 mRNA的相對表達量分別為1、1.033±0.055、0.400± 0.023（F=318.953，P＜ 0.001）。敲減UBE3A組的USP25 mRNA表達量較空白組明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.001），陰性對照組與空白組比較，差異無統計學意義（P=0.288），實驗結果表明敲減UBE3A后USP25mRNA表達明顯降低（圖4）。

2.5 敲減UBE3A后觀察USP25蛋白的表達水平在空白組、陰性對照組、敲減UBE3A組USP25蛋白的相對表達量分別為0.551±0.030、0.539±0.014、0.207 ± 0.010（F=293.410，P＜ 0.001）。敲減UBE3A組USP25蛋白的表達量較空白組明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.001），陰性對照組與空白組比較，差異無統計學意義（P=0.472），實驗結果表明敲減UBE3A后USP25蛋白表達明顯降低（圖5、6）。

圖4 Q-PCR檢測敲減UBE3A后USP25mRNA的表達水平Fig.4 Expressionof USP25mRNA after UBE3A knockdown detected by Q-PCR

圖5 Western Blot檢測敲減UBE3A后USP25蛋白的表達水平Fig.5 Expression of USP25 protein after UBE3A knockdown detected by Western Blot

圖6 Western Blot檢測敲減UBE3A后USP25蛋白的表達水平Fig.6 Expression of USP25 protein after UBE3A knockdown detected by Western Blot

3 討論

本組實驗結果觀察到UBE3A在乳腺癌組織中高表達，并且與Ki-67的表達及淋巴結轉移有密切關系。UBE3A的表達與Ki-67的表達相關（P＜0.001），在Ki-67高表達組（Ki-67≥14%）陽性表達率遠遠高于Ki-67低表達組（Ki-67＜14%），Ki-67是一種細胞增殖標志物，表達越高腫瘤細胞增殖越活躍，這可能提示UBE3A與乳腺癌細胞的增殖有關；UBE3A的表達與淋巴結轉移相關（P=0.001），其陽性率在有淋巴結轉移患者中明顯高于無淋巴結轉移者，可能提示UBE3A與乳腺癌細胞的轉移有關。有研究報道，在乳腺癌細胞中敲減UBE3A基因可使annexinA2表達下調，同時抑制乳腺癌細胞的增殖、浸潤、轉移及誘導細胞凋亡，UBE3A基因可能通過調節annexinA2的表達而影響乳腺癌細胞的增殖、浸潤、轉移等［12］。在肝細胞癌中UBE3A介導sirt6降解，促進了癌細胞的增殖、遷移和侵襲，且在肝細胞癌的小鼠模型中證實，sirt6的下調和隨后誘導的annexinA2是UBE3A介導腫瘤發生的關鍵［13］。

本組實驗結果中USP25在乳腺癌組織中高表達，且和組織學分級（病理分化程度）、Ki-67的表達、淋巴結轉移有關。USP25在乳腺癌組織中的表達與組織學分級（病理分化程度）相關（P=0.046），其陽性率隨著分化程度降低而逐漸升高，在高分化腫瘤中的陽性率低于低分化腫瘤，這可能與乳腺癌從高分化到低分化的惡性進展密切相關；USP25的表達與Ki-67的表達相關（P=0.029），且在Ki-67高表達組（Ki-67≥14%）陽性表達率遠遠高于Ki-67低表達組（Ki-67＜14%），Ki-67是細胞增殖標志物，此結果可能提示USP25的表達和乳腺癌增殖有密切關系；USP25的表達與淋巴結轉移相關（P=0.041），其陽性率在有淋巴結轉移患者中明顯高于無淋巴結轉移者，可能表明USP25的表達與乳腺癌細胞的轉移有關。USP25在乳腺癌中的作用尚未見報道，但在非小細胞型肺癌（NSCLC）中，USP25高表達，并且USP25的表達與組織學分級、Ki-67的表達和淋巴結轉移等相關，進一步研究發現miR-200c能夠抑制USP25的表達從而抑制非小細胞型肺癌細胞的浸潤與轉移［14］。USPs家族中其他成員在乳腺癌中也有類似的報道：USP14在乳腺癌組織中表達增高，且與乳腺癌組織學分級、Ki-67和淋巴結狀態相關，在后續實驗中觀察到USP14促進乳腺癌細胞的增殖、遷移及抑制細胞凋亡，促進乳腺癌的發展［15］；USP21在三陰性乳腺癌（TNBC）細胞株中的表達明顯高于其他亞型乳腺癌，在TNBC細胞中敲除USP21后抑制細胞增殖、遷移和侵襲，研究證實USP21在乳腺癌中的上調促進了細胞的成瘤能力，并與NOD樣受體信號通路有關［16］。USP22在乳腺癌組織中高表達，并與淋巴結轉移、Ki-67等呈正相關，多元Cox回歸分析顯示USP22表達水平是總體存活率或無病生存率的一個獨立的預后因素［17］。

實驗結果表明UBE3A與USP25在乳腺癌組織中均高表達，且在乳腺癌MCF-7細胞中敲減UBE3A后USP25基因及蛋白的表達量明顯降低（P＜0.001），這可能提示UBE3A與USP25在乳腺癌泛素蛋白酶體系統中功能作用更加活躍且保持動態平衡，這與相關文獻報道是一致的。DENG等［10］使用RFDD-PCR及2-DE為基礎的蛋白質組學方法對泛素-蛋白酶體系統組成部分進行觀察，結果發現5個蛋白酶體亞單位基因（PSMB5、PSMD1、PSMD2、PSMD8與PSMD11）、4個泛素特異性蛋白酶基因（USP9X、USP9Y、USP10與USP25）及1個泛素蛋白連接酶E3A基因（UBE3A）在乳腺癌組織中表達上調（＞3倍），其結果提示乳腺癌中泛素-蛋白酶體系統泛素化及去泛素化活動均明顯加強，乳腺癌的發生發展可能與泛素-蛋白酶體系統多環節、多步聚功能改變有關。

綜上，UBE3A與USP25在乳腺癌組織中高表達，且與乳腺癌細胞的增殖、轉移等生物學行為相關，在乳腺癌泛素蛋白酶體系統中UBE3A與USP25功能作用明顯增強且保持動態平衡，它們可能共同作用促進乳腺癌的的發生發展。因而，在乳腺癌的治療中，可能通過降低UBE3A或USP25的表達，或者通過抑制UBE3A調控USP25的表達，從而抑制乳腺癌細胞的增殖、轉移等生物學行為。目前，關于泛素蛋白酶體系統及組成成員抑制劑的研究報道較多，部分已經用于臨床［18-22］。針對UBE3A或USP25表達陽性的乳腺癌患者，使用特異性的抑制劑減少乳腺癌細胞的增殖、轉移成為可能。然而，此次研究樣本量還不足夠大，后期還需要擴大樣本量進一步證實實驗結果；另外，UBE3A與USP25在乳腺癌中的作用機制還不十分清楚，以及UBE3A如何調控USP25的表達等都還需進一步研究。