MicroRNA-29a-3p調控轉化生長因子β1誘導的人角膜基質細胞的肌成纖維細胞轉化

李凌菡 郝朋 李軒天津醫科大學眼科臨床學院（天津300070）；天津市眼科醫院，天津市眼科研究所，天津市眼科學與視覺科學重點實驗室（天津30000）

角膜基質是角膜組織的重要組成結構，其厚度約占角膜總厚度的90%［1］。近年來各種角膜區域的手術數量漸增，手術過程中難免發生角膜基質的損傷［2］。所以對角膜基質的損傷反應和愈合機制的研究變得意義非凡。深入研究基質創傷愈合及其機制，盡早開發出預防和治療基質纖維化的有效方法，有重大的臨床意義。

微小RNA29（microRNA-29，miR-29）的靶基因功能廣泛，組織細胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學過程均與其關系密切。目前，已被證實的miR-29靶基因有40余個［3］，其中最主要的是膠原蛋白［4］。膠原蛋白的大量產生造成細胞外基質（extracellular matrix，ECM）沉積會引起組織器官纖維化，而miR-29可直接抑制多種膠原蛋白表達，這提示了其潛在的抗纖維化功能。miR-29又可以分為miR-29a、miR-29b和miR-29c 3種亞型，其中，miR-29b又可以分為miR-29b1和miR-29b2。本研究選用miR-29的亞型為miR-29a。

轉化生長因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）廣泛存在于各種正常及轉化細胞中，參與體內許多重要的生理過程，如細胞增殖、遷移、分化、凋亡和細胞外基質生成等；參與幾乎所有器官（如肝臟、肺、腎、心臟等）及組織（如角膜、椎間盤、皮膚等）的纖維化過程［5-6］。而TGF-β可分為TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。據已有的研究顯示，角膜基質細胞激活轉變為肌成纖維細胞后會開始表達平滑肌肌動蛋白α（α-smooth muscle actin，αSMA），故αSMA可作為肌成纖維細胞轉化過程中一個可被檢測的特異性指標［7］。基于miR-29的抗纖維化潛能以及TGF-β在多種組織細胞纖維化過程中的重要作用，本研究主要探討miR-29a對TGF-β1體外誘導人角膜基質細胞的肌成纖維細胞轉化的抑制作用，以期為臨床工作中延緩或是治療角膜基質纖維化提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養本實驗采用5代以內人角膜基質細胞（美國science cell）。本研究通過天津醫科大學實驗倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑及儀器主要試劑：TGF-β1（美國R&D SYSTEMS），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美國Gibco公司），培養基FM（美國science cell），培養基DME/F12（美國Hyclone），青鏈霉素混合液（青霉素10×103U/mL，鏈霉素10×103μg/mL）（美國Gibco公司），Hsa-miR-29a-3p轉染試劑盒及引物套盒（蘇州吉瑪基因股份有限公司），細胞增殖/毒性檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）（日本DOJINDO研究所），2.5 g/L胰蛋白酶（美國Biotopped公司），細胞總RNA提純試劑盒（北京天根生化科技有限公司），實時定量PCR引物（上海生物工程有限公司），MMLV逆轉錄酶、Taq DNA聚合酶（美國Promega）；SYBR Premix Ex TaqⅠ（日本Takara）。BCA蛋白濃度測試試劑盒（美國Thermo），蛋白marker（美國Biotopped），兔單克隆抗體（美國Proteintech）。主要耗材及儀器：CO2培養箱（德國Heraeus），酶標儀（美國Thermo），實時熒光定量基因擴增儀（美國Appllied Biosystems），Odyssey雙色紅外激光成像系統（美國LI-COR公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養選用5代以內人角膜基質細胞，培養條件：培養基FM+5%FBS混合液。當細胞達60%～70%的細胞單層融合時，DME/F12+1%青鏈霉素混合液饑餓過夜后轉染miR-29a，轉染時無FBS和青鏈霉素混合液，轉染24 h后更換新鮮培養基（DME/F12+0%FBS+0%青鏈霉素混合液）加入5 ng/mL TGF-β1作用48 h。全程細胞培養條件：5%CO2，37℃孵箱。

1.2.2 實驗分組根據實驗目的，實驗分設6組，對照組（Control group）、TGF-β1組（TGF-β1 group）、miR-29a過表達對照+TGF-β1組（AgoNC+TGF-β1 group）、miR-29a過表達+TGF-β1組（Ago29a+TGF-β1 group）、miR-29a抑制表達對照+TGF-β1組（AntNC+TGF-β1 group）及miR-29a抑制表達+TGF-β1組（Ant29a+TGF-β1 group）。

1.2.3 CCK-8試劑盒檢測細胞活性在96孔板內按照實驗組設計接種人角膜基質細胞，細胞接種密度為1 000～2 000個/孔，24 h后細胞貼壁并基本單層融合，饑餓過夜處理后按實驗目的分組，分別處理各組細胞。細胞按實驗設計處理完畢后，去除各孔內液體，加入10%CCK-8（CCK-8：10 μL+DME/F12：90 μL），并設置無細胞空白對照。5%CO2，37℃孵箱培養2 h后，使用酶標儀選取波長450 nm，讀各孔吸光度（OD）值，各分組均設置復孔3個，重復3次。

1.2.4 實時熒光定量PCR法檢測人角膜基質細胞miR-29a及αSMA的mRNA相對表達量在6孔板內按照實驗組設計接種人角膜基質細胞，細胞接種密度為500×106個/孔，觀察細胞貼壁情況，24 h后細胞基本單層融合，饑餓過夜處理后再按實驗設計的分組處理各組細胞。細胞按實驗設計處理完畢后，采用細胞總RNA提純試劑盒提取各組細胞的總RNA，逆轉錄成cDNA后-20℃保存。采用實時熒光定量基因擴增儀對各組cDNA進行目的基因擴增，其中，相關引物：miR-29a上游引物：CTGCCGTAGCACCATCTGA；下游引物：TATCCTTGTTCACGAACTCCTTCAC；U6上游引物：CTCGCTTCGGCAGCACA；下游引 物 ：AACGCTTCACGAATTTGCGT；GAPDH上游引物：TGCCCTCAACGACCACTTTG；下游引物：CTGGTGGTCCAGGGGTCTTA；αSMA 上游引物：AAAGCAAGTCCTCCAGCGTT；下游引物：GCTTCACAGGATTCCCGTCT。反應體系：10 μmol/L的目的基因上下游引物各0.5 μL、無菌去離子水7.8 μL、Rox 0.2 μL、SYBR Green 10 μL及 cDNA 1 μL。擴增程序：95 ℃預變性 3 min，95℃變性12 s，62℃退火延伸40 s，共40個循環。熔解曲線分析條件為：95℃反應15 s，60℃反應1 min，95℃反應15 s，最后4℃冷卻降溫。各組均設置3個復孔，至少重復3次。結果分別以U6、GAPDH為內參，應用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。

1.2.5 Western Blot法檢測αSMA蛋白的相對表達量在6孔板內按照實驗組設計接種人角膜基質細胞，細胞接種密度為500×106個/孔，24 h后細胞貼壁并基本單層融合，饑餓過夜處理后按實驗目的分組，分別處理各組細胞。細胞按實驗設計處理完畢后，去除各孔內液體，提取細胞總蛋白，采用BCA法測定各組樣本蛋白濃度。向各組蛋白樣本中加入5 μL的5×蛋白上樣緩沖液，100℃10 min使蛋白變性。根據測定的蛋白濃度確定各組樣本上樣量，SDS-PAGE電泳后轉膜采用PVDF膜，后續采用Odyssey雙色紅外激光成像系統曝光，實驗至少重復3次。

1.3 統計學方法采用SPSS 23.0以及GraphPad Prism 8.0軟件對實驗數據進行分析，本研究實驗數據以3次獨立實驗的均值±標準差表示。兩組樣本間采用單因素方差分析及t檢驗對實驗數據進行分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人角膜基質形態人角膜基質細胞呈多角形，樹突狀，排列規則。

2.2 各組細胞活性比較按實驗設計處理細胞后，各組OD值（圖1）：對照組（0.874±0.050）、TGF-β1組（0.879± 0.200）、miR-29a過表達對照+TGF-β1組（1.068± 0.002）、miR-29a過表達+TGF-β1組（0.931± 0.058）、miR-29a抑制表達對照+TGF-β1組（0.871±0.010）及miR-29a抑制表達+TGF-β1組（0.979±0.006）。且各組間OD值均值差異無統計學意義（P＞0.05），提示各組細胞在實驗條件處理后細胞活力基本相同。

圖1 各組細胞CCK-8在波長450 nm處讀取的OD值比較Fig.1 Comparison of OD values at wavelength 450 nm read by CCK-8 in each group

2.3 RT-PCR檢測miR-29a及αSMA的mRNA在人角膜基質細胞中的表達RT-PCR結果（圖2）提示轉染效果良好，miR-29a的過表達（P＜0.001）和抑制表達（P=0.012）分別與其對照組相比差異有統計學意義。圖3為不同實驗條件下的各組細胞αSMA的相對表達量，可見與對照組比較，TGF-β1組αSMA mRNA表達顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.001）；miR-29a過表達+TGF-β1組與miR-29a過表達對照+TGF-β1組相比，αSMA的相對表達量明顯降低，差異有統計學意義（P=0.001）；而該指標在miR-29a抑制表達+TGF-β1組與miR-29a抑制表達對照+TGF-β1組的比較中增高且差異有統計學意義（P=0.019）。

圖2 各組細胞轉染miR-29a后細胞內miR-29a在核酸水平相對表達量Fig.2 Relative expression of intracellular miR-29a at nucleic acid level after miR-29a transfected in each group

2.4 Western Blot法檢測αSMA蛋白的相對表達量Western Blot結果（圖4）顯示，角膜基質細胞中αSMA蛋白的表達水平與mRNA的表達趨勢基本一致，對照組、TGF-β1組、miR-29a過表達對照+TGF-β1組、miR-29a過表達+TGF-β1組、miR-29a抑制表達對照+TGF-β1組及miR-29a抑制表達+TGF-β1組αSMA蛋白的相對表達量分別是：（0.012±0.001 1）、（0.026 ± 0.001 1）、（0.027 ± 0.001 8）、（0.018±0.000 8）、（0.018 ± 0.001 9）、（0.023 ± 0.001 8）。其中，對照組與TGF-β1組相比αSMA的相對表達量顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.001）；miR-29a過表達+TGF-β1組與miR-29a過表達對照+TGF-β1組相比，αSMA的相對表達量明顯降低，差異有統計學意義（P=0.007）；而該指標在miR-29a抑制表達+TGF-β1組與miR-29a抑制表達對照+TGF-β1組的比較中增高且差異有統計學意義（P=0.034）。

圖3 各組細胞內αSMA mRNA的相對表達量Fig.3 Relative expression of αSMA mRNA in each group

圖4 Western Blot圖像及量化結果Fig.4 The image and quantification results of Western Blot

3 討論

現有的研究［8-11］結果表明，角膜基質細胞在受到損傷刺激之后會被激活，由靜止狀態向修復表型轉變，其屬性也將發生改變，成為成纖維細胞，同時獲得遷移活性，進而向損傷區域遷移覆蓋，再通過肌成纖維細胞轉化，促進再生或誘導纖維化，起到修復損傷的作用。

TGF-β1是一種細胞因子，在體外培養時能誘導成纖維細胞轉變為肌成纖維細胞從而促進纖維化［12-16］。其中TGF-β1主要是通過誘導ECM產生、抑制ECM的降解來推進整個纖維化的進程。本研究采用TGF-β1體外誘導人角膜基質細胞發生纖維化反應，并通過RT-PCR及Western blot法檢測在對照組、TGF-β1組中αSMA在核酸、蛋白水平的相對表達量，結果提示TGF-β1組中αSMA的表達顯著升高，且差異有統計學意義。該結果也再次證實了TGF-β1可以用來體外誘導人角膜基質細胞發生肌成纖維細胞轉化。

纖維化的發生及發展涉及多種相關調節因子，是一個十分復雜的過程。多方面的研究結果顯示，miR-29可以通過阻斷TGF-β1/Smad3信號通路來減弱纖維化反應，尤其是在肺纖維化［17］、肝纖維化［18］、腎纖維化［19］以及心梗后心肌組織纖維化［20］。本研究將首次報道miR-29a對TGF-β1體外誘導人角膜基質細胞發生肌成纖維細胞轉化的負性作用，結果根據αSMA在核酸、蛋白水平的相對表達量顯示，在miR-29a過表達+TGF-β1組與miR-29a過表達對照+TGF-β1組、miR-29a抑制表達+TGF-β1組與miR-29a抑制表達對照+TGF-β1組中，miR-29a的高表達能有效減弱TGF-β1所誘導的纖維化反應，而抑制miR-29a的表達則能增強該反應。

與此同時，本研究還發現在特異性地調控人角膜基質細胞內的miR-29a含量后加入TGF-β1誘導該細胞反生纖維化反應并不會影響細胞的活性，這點可以從本研究中CCK-8的結果得到證實。

綜上所述，通過特異性地上調人角膜基質細胞內miR-29a的含量，從而可以達到抑制角膜基質細胞發生肌成纖維細胞轉化的作用，或可進而抑制或延緩角膜組織纖維化的發生和發展。本研究開篇有提到現階段已證實的miR-29靶基因大多是膠原蛋白，本研究后續也將根據miR-29的靶基因預測結果從膠原蛋白的表達方面進行一系列檢測以佐證本研究的結果，同時力求在miR-29所涉及的具體調控途徑進行更多更深層次的研究。