鈣衛(wèi)蛋白對口腔鱗狀細胞癌細胞侵襲遷移的影響及機制

孫俊澤 馬洪 胡赟 鮑玲娜 劉睿 康劍勇 孫昆俊

貴州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院1口腔頜面外科，2病理科（貴陽550001）

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是常見嚴重危及健康的惡性腫瘤，在口腔惡性腫瘤中達80%以上，有高度的惡性、強侵襲、快轉(zhuǎn)移等特性，惡性腫瘤排名第六［1］，病死率仍逐年上升，存活率很低主要與腫瘤侵襲和遠處轉(zhuǎn)移關聯(lián)密切［2］。因此，尋求早期診斷和靶向抑制其發(fā)生進展及轉(zhuǎn)移是防止和治療OSCC的關鍵［3］。S100A8/A9蛋白是以Ca2+依賴形式的一種鈣結合蛋白，在癌變的起始、促進和演變的每一階段發(fā)揮作用。隨著S100A8/A9研究領域的不斷深入，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)S100A8/A9在胃癌、結直腸癌及鼻咽癌等腫瘤性疾病中異常表達，并在轉(zhuǎn)移過程中建立預轉(zhuǎn)移性龕，促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移［4］。S100A8/A9蛋白可能成為一種新的基因治療手段或腫瘤診斷預后標志，但S100A8/A9蛋白在OSCC侵襲遷移中的作用和機理尚未報道，本次體外實驗旨在探究S100A8/A9蛋白對OSCC細胞侵襲遷移及PI3K/AKT信號通路的影響，為OSCC靶向藥物研發(fā)以及進一步實驗提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及細胞株舌鱗癌細胞SCC-25和CAL-27（ATCC，USA），S100A8蛋白和S100A9蛋白（Abcam，USA），胎牛血清（BI，IRS），DMEM-F12培養(yǎng)基和高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco，USA），鼠抗人pakt、兔抗人akt多克隆抗體、抗gapdh抗體及二抗（Proteintech，USA），通路抑制劑LY294002（MCE，USA），顯影液（Millipore，USA），CCK-8試劑盒（Biosharp，CHN），Transwell小室、培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿（Corning，USA），基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloprotease 2，MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotease 2，MMP-9）序列設計（Ribobio，CHN），RNA提取試劑盒（Roche，DE），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA，JP）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)在含有DMEM-F12/DMEM培養(yǎng)基的25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)SCC-25和CAL-27，培養(yǎng)的環(huán)境設置為37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，等到細胞生長大約80%左右時候然后進行傳代。

1.2.2 CCK-8檢測細胞增殖活性收集對數(shù)周期的細胞先后沖洗、消化、調(diào)整細胞密度，在96孔板培養(yǎng)使每孔約含103個細胞，將S100A8和S100A9重組蛋白混合并在4℃下孵育1 h以形成S100A8/A9蛋白復合物［5］，細胞基本貼壁后，調(diào)整S100A8/A9蛋白濃度為0、1、5、15、25、35 μg/mL的無血清培養(yǎng)基，24 h的時候在每個孔加入10 μL CCK8藥劑，1.5 h后開始用酶標儀在450 nm波長的測吸光度數(shù)的值（Optical Density，OD）。

1.2.3 劃痕實驗收集對數(shù)周期的細胞密度大約為1×105個/mL，細胞基本貼壁后，輕輕用槍頭垂直孔板后的劃線，清洗劃下來的多余細胞，加入不含血清的培養(yǎng)基，設置S100A8/A9組及Control組，S100A8/A9 組中加入 1 μg/mL S100A8/A9蛋白，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，于0、24、48、72 h進行拍照。

1.2.4 細胞的遷移實驗和侵襲實驗收集對數(shù)周期的細胞先后清洗、消化、調(diào)整合適的細胞密度。在Transwell侵襲小室的上室加1× 105個/200 μL細胞，下室加入含有1 μg/mL S100A8/A9蛋白600 μL的培養(yǎng)基，24 h后小室取出清洗，多聚甲醛固定液固定，用結晶紫染色，清洗、干燥后在倒置顯微鏡下隨機選取5個視野計算細胞數(shù)。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法按照細胞的裂解方法提細胞總蛋白，每條泳道含有60 μg總蛋白，電泳完成后將10%SDS-PAGE膠上目的蛋白轉(zhuǎn)到膜上面，在室溫條件下封閉大約2 h，一抗（1∶2 000）在4℃條件下過夜孵育，TBST洗3遍，在室溫條件下二抗（1∶8 000）孵育大約2 h；TBST洗3遍，成像系統(tǒng)下進行成像。圖形分析軟件Image J對圖片進行處理，用每一個組的p-akt、akt和gapdh蛋白灰度的比分析樣品蛋白的相對表達情況。

1.2.6 細胞免疫熒光染色收集對數(shù)周期的細胞，先后清洗、消化，調(diào)整細胞密度。根據(jù)蛋白質(zhì)印跡法結果設為0 h組、0.5 h組、3 h組，固定細胞，封閉，加入一抗p-akt（1∶50）4℃條件下過夜孵育，PBS沖洗3次，熒光二抗室溫避光孵育1 h，PBS沖洗3次，封片后熒光顯微鏡進行觀察和拍照。

1.2.7 實時定量熒光PCR檢測將細胞接種在24孔板中培養(yǎng)，實驗分為3個組，分別為：Control組（DMSO）、S100A8/A9組和抑制劑組（S100A8/A9+LY294002）。RNA的檢測方法參照試劑盒說明書，引物序列：GAPDH：F：5′-GTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3′，R：5′-ACCACCTTCTTGATGTCATCAT-3′；MMP-2：F：5′-CTGATGTCCAGCGAGTGGAT-3′，R：5′-CTTCACCTCATTGTATCTCCAGAA-3′；MMP-9：F：5′-CAGTACCGAGAGAAAGCCTATT-3′，R：5′-CAGGATGTCATAGGTCACGTAG-3′；以Control組作為對照組，計算Ct數(shù)值后，根據(jù)2-△△Ct算出各個組的mRNA相對表達情況。

1.3 統(tǒng)計學方法計量資料用（）表示，用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0進行分析，兩個組的比較用獨立樣本t檢驗，多個組的比較使用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 S100A8/A9蛋白對OSCC細胞增殖活力的影響不同濃度的S100A8/A9蛋白處理OSCC細胞24 h后，檢測S100A8/A9蛋白對細胞增殖活力的變化（圖1），細胞增殖活力有濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。用高濃度S100A8/A9蛋白（35 μg/mL）處理的細胞活力下降，而用低濃度S100A8/A9蛋白（1 μg/mL）處理的細胞活力增加，有研究表明，0.4 μg/mL 和 2 μg/mL 的 S100A8/A9蛋白，能刺激結直腸癌和胰腺癌細胞的侵襲和和遷移［6］，結果與本實驗相一致，因此，在隨后的實驗中，用1 μg/mL S100A8/A9蛋白處理細胞進行實驗。

2.2 S100A8/A9蛋白對OSCC細胞侵襲遷移的影響

2.2.1 細胞劃痕實驗在不同時間點觀察并計算遷移面積見圖2。與Control組相比，隨著時間變化細胞生長向劃痕的地方遷移，S100A8/A9組的劃痕區(qū)域小于同一時間點的Control組。

2.2.2 Transwell實驗Transwell小室在400×下觀察，計算聚碳酸酯膜上面的細胞數(shù)，比較S100A8/A9組與Control組差異（圖3），遷移實驗的結果示，S100A8/A9組［（82± 4.16），（89± 3.06）］細胞遷移數(shù)明顯要比Control組［（59± 4.83），（57± 2.35）］多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。侵襲實驗的結果示，S100A8/A9組［（88±3.17），（91±3.91）］細胞侵襲數(shù)明顯要比Control組［（60±1.06，59±1.84）］多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

圖1 以不同濃度的S100A8/A9蛋白對SCC-25及CAL-27細胞增殖的影響Fig.1 Effect of S100A8/A9 on the proliferation of SCC-25 and CAL-27 cell

圖2 劃痕實驗下S100A8/A9蛋白對SCC-25和CAL-27細胞遷移能力的影響Fig.2 Effect of s100a8/a9 protein on migration ability of SCC-25 and CAL-27 cells detected by would healing assay

圖3 S100A8/A9蛋白對SCC-25及CAL-27細胞遷移和侵襲能力中的作用Fig.3 Effect of S100A8/A9 protein on migration and invasion of SCC-25 and CAL-27 cells

2.3 S100A8/A9蛋白對OSCC細胞PI3K/AKT通路活化的影響添加S100A8/A9蛋白處理OSCC細胞后，磷酸化akt量在0.5 h內(nèi)明顯升高（圖4），3 h后磷酸化的akt表達量明顯降低，總akt蛋白表達量無明顯變化，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在含有或著不含有5 μmol/L LY294002的干預下，S100A8/A9蛋白處理細胞0.5 h后磷酸化的akt表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。細胞免疫熒光染色結果（圖5），細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)都觀察到p-akt表達量變化，與免疫印跡檢測的結果一致，提示S100A8/A9蛋白對PI3K/AKT通路存在激活作用。

圖4 S100A8/A9蛋白對SCC-25及CAL-27細胞PI3K/AKT通路的影響Fig.4 Effect of S100A8/A9 on PI3K/AKT signaling

圖5 p-akt在OSCC細胞中的定位表達（p-akt：綠色，標尺：20 μ m）Fig.5 Localized expression of p-akt in OSCC cells（p-akt：green，scale：20 μm）

2.4 阻斷PI3K/AKT信號通路后S100A8/A9蛋白對OSCC細胞侵襲和遷移的影響遷移實驗的結果見圖6。抑制劑組［（43± 2.65），（38±1.67）］細胞遷移數(shù)要比Control組［（56± 2.03），（57± 2.15）］和S100A8/A9組［（89±3.76），（93± 2.28）］明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.000 1）。侵襲實驗的結果示，抑制劑組［（40± 3.26），（38± 1.45）］細胞侵襲數(shù)要比Control組［（58± 2.24），（56± 2.44）］和S100A8/A9組［（88± 2.22），（93± 1.99）］明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.000 1）。

圖6 PI3K/AKT通路在S100A8/A9蛋白促進SCC-25及CAL-27細胞遷移和侵襲能力中的作用（標尺：20 μm）Fig.6 Role of PI3K/AKT pathway in S100A8/A9 protein promoting the migration of SCC-25 and CAL-27 cells（scale：20 μm）

2.5 MMP-2和MMP-9參與S100A8/A9蛋白誘導的OSCC細胞侵襲和遷移RT-qPCR檢測各組OSCC細胞中MMP-2及MMP-9基因表達量的比值（圖7），抑制劑組［（0.29 ± 0.23），（0.12 ± 0.04）］的MMP-2mRNA表達情況分別與Control組［（0.95±0.58），（0.48 ± 0.22）］和S100A8/A9組［（2.78 ± 0.62），（1.58±0.26）］相比呈低表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。抑制劑組［（0.22±0.16），（0.17±0.08）］的MMP-9mRNA表達情況分別與Control組［（0.66± 0.23），（0.58± 0.24）］和S100A8/A9組［（1.65±0.55），（1.22 ± 0.29）］相比呈低表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

3 討論

S100A8蛋白和S100A9蛋白是S100鈣結合蛋白家族的成員，主要在免疫細胞中表達，常以異二聚體S100A8/A9蛋白的結構存在，與Toll樣受體或晚期糖基化終末產(chǎn)物受體交互識別，激活PI3K/AKT、MAPK和NF-κB信號通路來調(diào)節(jié)自分泌和旁分泌，刺激腫瘤相關細胞募集和血管生成，從而促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移［7-8］。近年來發(fā)現(xiàn)S100A8和S100A9在鼻咽癌、結直腸癌、胃癌、乳腺癌等組織中異常高表達，均證實S100A8和S100A9參與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，并與腫瘤的不良預后密切相關［9-10］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)S100A8和S100A9在OSCC細胞間基質(zhì)中的浸潤細胞中異常高表達，與OSCC轉(zhuǎn)移和侵襲性相關［11-12］。基于前期實驗和國外研究報道，進一步深入探討和研究S100A8/A9蛋白對口腔鱗癌細胞侵襲遷移的影響及機制。

圖7 S100A8/A9蛋白經(jīng)PI3K/AKT通路調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9蛋白表達中的作用Fig.7 Role of PI3K/AKT on S100A8/A9 protein in Regulation of MMP-2and MMP-9 protein expression

本研究選取2種口腔鱗癌細胞株采用CCK8檢測不同濃度的S100A8/A9蛋白對其增殖活性的影響，隨后采用劃痕實驗、Transwell實驗和Western blot等實驗檢測低濃度S100A8/A9蛋白下的OSCC細胞的遷移和侵襲能力及可能的機制。通過添加外源性低濃度S100A8/A9蛋白處理OSCC細胞后，劃痕實驗和Transwell實驗檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，低濃度S100A8/A9蛋白組OSCC細胞的遷移和侵襲能力增加，提示低濃度S100A8/A9蛋白促進OSCC細胞的遷移和侵襲，研究報道，高濃度（30 μg/mL）的S100A8/A9蛋白在胃癌細胞中發(fā)揮凋亡作用，低濃度（1 μg/mL）促進遷移和侵襲［13］，這與本研究結果一致。PI3K/AKT信號通路在誘導腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關鍵作用［14］。本研究結果發(fā)現(xiàn)，低濃度S100A8/A9蛋白增加OSCC細胞akt的磷酸化，同時細胞免疫熒光染色中細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)也觀察到p-akt表達量變化，提示低濃度S100A8/A9蛋白可能激活了細胞內(nèi)PI3K/AKT通路，這與S100A8/A9蛋白通過激活PI3K/AKT通路，促進胰腺癌細胞增殖和侵襲一致［15-16］。此外，本研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT的激活與S100A8/A9誘導的細胞遷移和侵襲有關，這可通過PI3K/AKT抑制劑減弱細胞的遷移和侵襲來證明，本研究結果發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT抑制劑能有效抑制OSCC細胞遷移侵襲能力，這與 SMOLENSKY 等［17］結果一致，暗示PI3K/AKT抑制劑在OSCC的臨床應用和臨床試驗中作為抗癌藥物的使用中具有巨大潛力。因此，低濃度S100A8/A9蛋白可能通過激活PI3K/AKT信號通路，促進OSCC細胞的遷移和侵襲。

腫瘤細胞和細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）間粘附狀態(tài)是影響OSCC細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移重要的因素［18-19］，MMPs可以誘導ECM的降解，MMPs表達量的降低將會導致ECM重構，因此也被認為是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的標志［20］，MMPs中其MMP-2和MMP-9與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移關系緊密［21］，研究報道，MMP-2和MMP-9可能是PI3K/AKT信號通路下游的靶基因，PI3K/AKT信號通路激活后上調(diào)MMP-2和MMP-9誘導胃癌細胞的EMT過程［15］，本研究進一步發(fā)現(xiàn)，S100A8/A9蛋白組MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表達量上調(diào)，OSCC細胞遷移侵襲能力增加，抑制劑組MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表達量下調(diào)，OSCC細胞遷移侵襲能力減弱。說明MMP-2和MMP-9表達的變化與PI3K/AKT信號通路有關，進而影響OSCC細胞轉(zhuǎn)移能力。因此，筆者推測S100A8/A9蛋白可能通過激活PI3K/AKT信號通路上調(diào)MMP-2和MMP-9，促進OSCC細胞的遷移和侵襲。

綜上所述，低濃度S100A8/A9蛋白可能通過活化P13K/AKT信號通路，促進OSCC細胞的遷移和侵襲。本研究存在S100A8/A9蛋白復合物的基因敲除技術難度高和缺乏體內(nèi)實驗問題，造成了一定的局限性，本課題組后期將解決這些問題來進一步驗證，并構建裸鼠腫瘤模型，繼續(xù)研究S100A8/A9對OSCC的作用及機制。其本次研究的結果及進一步的深入研究將在OSCC治療方面提供新的依據(jù)。