肝性脂肪酸結(jié)合蛋白基因單核苷酸多態(tài)性表達(dá)與NAFLD的相關(guān)性

姜華 高建鵬 胡陽 張志波 宋丹 王鑫

昆明延安醫(yī)院消化內(nèi)科（昆明650000）

非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是世界上最常見的慢性肝病之一［1］，NAFLD與肥胖、炎癥、胰島素抵抗、2型糖尿病等代謝性疾病相似［2］，是肝臟代謝綜合征的表現(xiàn)，其包括簡單的非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）［3］、纖維化和肝硬化，甚至肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。在歐洲，由于肥胖和衰老等風(fēng)險(xiǎn)因素，NAFLD的患病率逐年增加［4］。隨訪研究表明，NAFLD在普通人群中普遍存在，NAFLD的增趨勢明顯［5］。NAFLD與2型糖尿病有著密切的關(guān)系。然而，NAFLD發(fā)病和進(jìn)展的確切機(jī)制仍不完全清楚［6-8］。

肝性脂肪酸結(jié)合蛋白（liver fatty acid-binding protein，F(xiàn)ABP1）是脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP）超家族的成員，其在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中大量存在。它通過影響脂肪酸的攝取，運(yùn)輸，線粒體氧化和酯化作為肝臟脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑［9］。FABP1在第94位（T94A）的蘇氨酸（T）至丙氨酸（A）突變最初在2004年被確定［10］，F(xiàn)ABP1 T94A變異蛋白的表達(dá)與NAFLD患病率的增加有關(guān)［11］。人類FABP1基因變異被證明與空腹血清膽固醇和三酰基甘油水平升高有關(guān)，這與增加有關(guān)心血管疾病，2型糖尿病和代謝綜合征的風(fēng)險(xiǎn)［12］。鑒于較高的血清膽固醇和三酰基甘油也與NAFLD相關(guān)［13］。學(xué)者推測FABP1中的變異也可能歸因于NAFLD的發(fā)展，肝臟FABP1的減少是對抗NAFLD的有效途徑［14］。本研究探討FABP1遺傳變異與NAFLD易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料及納入標(biāo)準(zhǔn)研究人群包括2015年9月至2018年9月在本院就診的80例非酒精性脂肪肝患者（年齡20～74歲）。患有以下任何疾病的患者被排除參與本研究：自身免疫性肝炎，藥物性肝病，原發(fā)性膽汁性肝硬化和原發(fā)性硬化性膽管炎。在研究期間，從同中心招募了80例健康志愿者。本研究中進(jìn)行的所有調(diào)查均按照1975年赫爾辛基宣言的指導(dǎo)方針進(jìn)行，并根據(jù)當(dāng)?shù)蒯t(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)的程序獲得個(gè)人的書面同意。

1.2 人體測量和生化評估所有受試者在禁食過夜后的早晨進(jìn)行完整的身體檢查。檢查包括人體測量，健康相關(guān)行為問卷調(diào)查和生化測定。BMI計(jì)算如下：BMI= 體質(zhì)量（kg）/身高平方（m2）。在人體測量檢查后抽取靜脈血樣。除肝功能測試外，還通過標(biāo)準(zhǔn)臨床實(shí)驗(yàn)室技術(shù)測量總膽固醇，高密度膽固醇和低密度膽固醇，甘油三酯和血漿葡萄糖的水平。

1.3 基因型分析用DNAZOL（Invitrogen，Germany）從靜脈血中提取基因組DNA。使用HapMap數(shù)據(jù)庫中（http：//www.hapmap.ncbi.nlm.nih.gov）中的基因型數(shù)據(jù)來標(biāo)記SNP。使用HaploviewV4.2軟件的成對標(biāo)記方法（http：//www.broad.mit.edu/mpg/haploview）來捕獲SNP，其中設(shè)定最小次等位基因頻率（minimum minor allele frequency，MAF）＞0.10且最小r2＞0.8。研究發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)標(biāo)簽SNP，其MAF大于10%（rs1545224 G/A，位于內(nèi)含子3；rs2241883 T/C，位于外顯子3），代表了HapMap數(shù)據(jù)庫中的五個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)（r2＞0.8）。接下來使用等位基因特異性MALDI-TOF質(zhì)譜分析在Sequenom Mass Array iPLEX平臺進(jìn)行基因分型。使用Mass Array Assay Design Version 3.1軟件（Sequenom，San Diego，CA）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并且根據(jù)iPLEX方案獲得SNP基因型。

1.4 功率計(jì)算關(guān)聯(lián)性分析的power取決于樣本大小、指定的Ⅰ型錯(cuò)誤水平以及患者和對照組的基因型頻率。基因型頻率取決于感興趣等位基因的總體頻率及其對疾病易感性的影響。利用Genetic Power Calculator對個(gè)體多態(tài)性數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)顯著性結(jié)果的power值進(jìn)行估計(jì)。基于本研究中的等位基因頻率和樣本量，研究結(jié)果表明，在顯性模型下，rs1545224的power＞90%，rs 2241883的power＞80%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法表型定量數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。利用t檢驗(yàn)，Pearson′s χ2或非參數(shù) Mann-WhitneyU檢驗(yàn)評估患者組和對照組之間臨床特征的差異。用χ2試驗(yàn)檢測正常人的Hardy-Weinberg平衡（HWE）。無條件單變量和多變量Logistic回歸分析獲得NAFLD風(fēng)險(xiǎn)的原始讓步比（odds ratios，OR）及其95%置信區(qū)間（CI）。年齡、性別、婚姻、教育或入境狀態(tài)、BMI、ALT和AST等混雜因素也被包括在多變量邏輯回歸模型中。本研究使用Haploview 4.2軟件構(gòu)建單倍型。用基于R語言的Haplo.stats軟件估計(jì)每個(gè)單倍型的OR值和95%CI［10］。使用SPSS 13.0進(jìn)行上述統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床特征NAFLD患者與對照組在年齡、性別、婚姻、文化程度、接收狀態(tài)等方面的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。與對照組相比，NAFLD 患者的 BMI、FPG、TG、TC、LDL-C、ALT和AST水平顯著升高，HDL-C水平較低（均為PB05）。見表1。

2.2FABP1基因SNPs與NAFLD的關(guān)聯(lián)SNP信息、等位基因頻率和Hardy-Weinberg檢驗(yàn)結(jié)果顯示，NAFLD患者rs1545224 A和rs2241883C等位基因頻率分別為0.498和0.229，對照組分別為0.439和0.198。在單變量分析中，通過置換試驗(yàn)進(jìn)行多次比較校正后，對照組與NAFLD（P=0.012）之間的rs1545224等位基因頻率存在顯著差異。而rs2241883的等位基因頻率在對照組和NAFLD患者之間沒有顯著差異（P=0.178）。所有的對照基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。兩種FABP 1基因多態(tài)性在NAFLD患者和對照組中的基因型分布及其與NAFLD風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系見表3。病例組與對照組基因型分布有顯著性差異（rs1545224為0.007，rs2241883為0.047）。用非條件Logistic回歸分析估計(jì)FABP1基因型與NAFLD風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。結(jié)果表明，經(jīng)年齡、性別、婚姻、文化程度或接收狀態(tài)、BMI、ALT、AST等因素調(diào)整后，rs1545224雜合的gA等位基因和純合子，AA等位基因均為NAFLD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。特別是與GG純合子等位基因者相比，攜帶雜合子GA和純合AA基因型的人患NAFLD的風(fēng)險(xiǎn)以等位基因劑量依賴的方式（PTrend=0.025）顯著增加（GA基因型OR=1.48，95%CI：1.09 ～ 2.00；AA基因型OR=1.63，95%CI：1.13～ 2.35）。當(dāng)GA和AA基因型匯集在一起進(jìn)行分析時(shí)還發(fā)現(xiàn)，和沒有這個(gè)等位基因的個(gè)體進(jìn)行比較，至少有一個(gè)rs1545224 A等位基因的個(gè)體的患病風(fēng)險(xiǎn)增加了1.52倍（95%CI：1.14～ 2.02，P=0.004）。 此外，rs2241883TC雜合子與NAFLD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)（調(diào)整OR=1.34，95%CI：1.02 ～ 1.76，P=0.033）。然而與rs2241883TT純合子相比，rs2241883CC純合子與未顯著升高的風(fēng)險(xiǎn)（調(diào)整OR=1.12，95%CI：0.60 ～2.09，P=0.722）相關(guān)。當(dāng)將CT和CC基因型合并分析時(shí)，和沒有這個(gè)等位基因的個(gè)體進(jìn)行比較，至少有一個(gè)rs2241883 C等位基因的個(gè)體的患病風(fēng)險(xiǎn)增加了1.32倍（95%CI：1.01～ 1.71，P=0.039）。見表2、3。

表1 NAFLD患者和對照組的臨床特征Tab.1 General data of patients with NAFLD and control Group x±s

表2 有關(guān)FABP1的兩個(gè)基因分型SNP的信息Tab.2 Information about two genotypes SNP of FABP1

2.3 rs2241883和rs1545224SNPs對NAFLD的累積效應(yīng)通過統(tǒng)計(jì)與NAFLD風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的基因型數(shù)來分析這兩個(gè)SNP的風(fēng)險(xiǎn)基因型，檢驗(yàn)FABP1與兩個(gè)SNPs的可能累積效應(yīng)。NAFLD病例的風(fēng)險(xiǎn)基因型往往高于對照組，有兩種風(fēng)險(xiǎn)基因型的患者NAFLD風(fēng)險(xiǎn)顯著增加（OR=1.65，95%CI：1.22～2.23），且隨著風(fēng)險(xiǎn)基因數(shù)目的增加，NAFLD風(fēng)險(xiǎn)顯著增加（P=0.001）。見表4。

3 討論

許多研究表明，F(xiàn)ABP1過表達(dá)增強(qiáng)了脂肪酸攝取，而FABP1基因消融則降低了肝臟脂肪酸攝取［15-16］。NAFLD是人類最常見的肝臟疾病［17］，雖然在嚙齒類動物模型中，環(huán)境因素（如高脂肪飲食）和遺傳因素都對NAFLD有影響，但是對于遺傳機(jī)制在人類NAFLD中的作用知之甚少［18］。多項(xiàng)研究表明，編碼人FABP 1基因在NAFLD中發(fā)揮重要作用［19］，人類NAFLD易感性或疾病進(jìn)展與基因的關(guān)系，個(gè)體遺傳變異對疾病易感性的影響仍不確定。

在本研究中，F(xiàn)ABP 1上的兩個(gè)標(biāo)簽SNPs（rs 2241883 T/C，第3外顯子，在編碼蛋白中出現(xiàn)T94A替換；rs1545224 G/A，內(nèi)含子3）與NAFLD風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs1545224雜合子GA等位基因、純合AA等位基因和rs 2241883雜合子TC等位基因與NAFLD風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。此外，在控制了潛在的混雜因素，如年齡、性別、BMI和其他變量后，由rs1545224 A和rs2241883 C變體組成的變異體與NAFLD的發(fā)病密切相關(guān)（P＜0.05）。因此，目前的數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)ABP基因多態(tài)性可能影響NAFLD的易感性。

表3 所選SNP的基因型與NAFLD風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)Tab.3 Association between genotypes of selected SNPs and NAFLD risk 例（%）

表4 FABP 1不利基因型對NAFLD的累積效應(yīng)Tab.4 Cumulative effect of adverse genotype FABP 1 on NAFLD 例（%）

rs2241883 T/C SNP是FABP 1中唯一的編碼SNP，并且能夠?qū)е轮袠O性氨基酸殘基蘇氨酸（T）在FABP 1中變?yōu)樾《杷谋彼幔ˋ）殘基。這一變化已被證明與心血管疾病、2型糖尿病和代謝綜合征的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)［20］。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)rs2241883 T/C變化也與NAFLD有關(guān)。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)rs2241883 TC/CC基因型與NAFLD患者較高的LDL-C水平，這與先前的發(fā)現(xiàn)一致。

FABP1是脂肪酸結(jié)合蛋白（FABPs）超家族成員之一，在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞胞漿中含量豐富［11］。FABP是肝臟脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，它影響長鏈脂肪酸（LCFAS）的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)、線粒體和過活受體α（pPARα）在追蹤LCFAs至細(xì)胞核過程中的配體依賴性反式激活。結(jié)果表明，同時(shí)含有兩個(gè)SNP風(fēng)險(xiǎn)等位基因的A-C單倍型與發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，表達(dá)的調(diào)節(jié)影響肝臟脂質(zhì)儲存，引起肝脂合成變化的原因。

FABP1基因多態(tài)性顯示，具有兩種風(fēng)險(xiǎn)基因型的個(gè)體NAFLD風(fēng)險(xiǎn)顯著高于無風(fēng)險(xiǎn)基因型的個(gè)體，且隨著風(fēng)險(xiǎn)基因型數(shù)量的增加，NAFLD的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。這些結(jié)果提示這些變異可能在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮聯(lián)合作用，具有風(fēng)險(xiǎn)型基因的個(gè)體具有NAFLD易感性。因此，研究FABP1基因多態(tài)性，探索NAFLD病因?qū)W特點(diǎn)，尋找NAFLD易感基因，提高對NAFLD發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，從而將有可能從基因水平上成為NAFLD防治的新靶點(diǎn)，為該疾病的診斷與治療提供新的途徑，更有效降低NAFLD和心腦血管以及代謝性疾病發(fā)生，提高人們生活質(zhì)量。

總之，關(guān)于FABP SNPs和NAFLD的該關(guān)聯(lián)研究表明FABP RS2241883T/C、RS1545224G/A及其單倍型可調(diào)節(jié)NAFLD的風(fēng)險(xiǎn)。這一研究能使人們更好地理解與NAFLD發(fā)病機(jī)制有關(guān)的復(fù)雜機(jī)制。但這些FABP1變異體的存在有待于進(jìn)一步的分子生物學(xué)和生化研究。