花生蛋白亞基組成對蛋白提取率及功能性質的影響

賈 聰，蘆 鑫，高錦鴻，孫 強，黃紀念，張麗霞

(河南省農業科學院 農副產品加工研究所，鄭州450000)

花生屬于豆科植物，是一種重要的油料蛋白資源。花生中蛋白質含量為24%～36%，花生蛋白營養價值較高，包括人體必需的8種氨基酸，具有易消化、不含營養抑制物質等優點，具有廣闊的市場發展前景[1]。花生蛋白根據其溶解性可分為水溶性蛋白(約10%)和鹽溶性蛋白(約90%)[2]。水溶性蛋白主要是清蛋白，在提取花生蛋白的過程中大部分易丟失。鹽溶性蛋白包括伴花生球蛋白Ⅰ、伴花生球蛋白Ⅱ和花生球蛋白[3]。伴花生球蛋白Ⅰ主要由3個亞基組成，相對分子質量在15.0～19.0 kDa之間；伴花生球蛋白Ⅱ含1個亞基，相對分子質量基本處于60～66 kDa之間；花生球蛋白主要有4個亞基，相對分子量處于20～45 kDa之間。有研究發現不同品種花生蛋白的亞基含量具有差異性，主要差異在于花生球蛋白亞基組成的不同[4-5]。榨油副產物花生粕的蛋白質含量高達50%，我國每年產生900多萬t花生粕，但大部分被用作飼料或肥料[6]，未資源化利用，資源浪費嚴重。

目前，花生蛋白研究主要聚焦在對花生蛋白的提取工藝優化和加工利用[7-9]，而關于花生蛋白組成(亞基)影響蛋白提取的研究鮮見報道。同時，為指導花生蛋白應用，研究了花生蛋白的功能性質(主要包括溶解性、乳化性、起泡性、持水性及持油性等)，雖然獲得一些進展，然而關于花生蛋白亞基如何影響其功能性質尚不明確。因此，開展花生蛋白亞基對花生蛋白提取與功能性質的影響研究，對預測花生品種在食品工業中的應用以及專用品種的選育具有重要意義。

本文采用堿溶酸沉法提取21個品種花生的蛋白質，利用SDS-PAGE分析花生蛋白亞基組成，并對花生蛋白提取率、溶解性、乳化性、起泡性、持水性及持油性進行測定，通過相關性分析明確花生蛋白亞基與蛋白提取率及功能性質的交互作用，為蛋白加工業中選擇適宜花生品種以及花生育種指導提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

花生，河南綠色油料作物研究中心提供；花生油，山東魯花集團有限公司。β-巰基乙醇、考馬斯亮藍R-250、過硫酸銨、溴酚藍，美國Sigma公司；電泳Marker (相對分子質量10～250 kDa)，上海雅酶生物科技有限公司；丙烯酰胺、N,N′-亞甲雙丙烯酰胺、甘氨酸、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺等，美國Amersco公司；2,2-聯喹啉-4,4-二甲酸二鈉(BCA)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)、冰醋酸、五水硫酸銅、硫酸鉀、鹽酸、氫氧化鈉，國藥集團化學試劑有限公司，以上試劑均分析純。

1.1.2 儀器與設備

DYY-12型電泳儀，北京市六一儀器廠；ULTRA-TURRAX型高速剪切乳化機，德國IKA公司；UV-6300型紫外分光光度計，上海美譜達公司；RRHP-350型粉碎機，上海頂帥電器有限公司；FD5-3型凍干機，德國SRK公司；DL-5-B型離心機，上海安亭科學儀器廠；DELTA 320型pH計，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；Gel-Doc XR+凝膠成像儀，美國伯樂生命醫學產品有限公司；K-05型自動定氮儀，上海晟聲自動化分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花生蛋白提取

將花生(花生品種如表1所示)去除紅衣后，粉碎過60目網篩，取200 g篩下物采用索氏抽提法去除油脂，花生粕與去離子水以1∶10混合，將分散液調節pH為11.0，40℃下攪拌1 h，5 000 r/min 離心30 min，取上清調pH為4.5，靜置20 min，5 000 r/min 離心30 min，取沉淀，凍干，得到粗提的花生蛋白。

表1 花生品種

1.2.2 花生蛋白提取率的測定

采用凱氏定氮法分別測定1.2.1中花生粕和堿溶酸沉法得到粗提物的花生蛋白含量。花生蛋白提取率的計算如式(1)所示。

花生蛋白提取率=粗提物質量×粗提物蛋白含量/(花生粕質量×花生粕蛋白含量)×100%

(1)

1.2.3 花生蛋白SDS-PAGE分析

將花生粕和粗提花生蛋白(均含4 mg蛋白)分別分散到1 mL樣品處理液(含0.05 mol/L pH 6.8 Tris-HCl，50 g/Lβ-巰基乙醇，20 g/L SDS，1 g/L溴酚藍，100 g/L甘油)中，沸水浴加熱10 min，10 000 r/min離心10 min后棄沉淀。電泳條件：分離膠質量分數為12.5%，濃縮膠質量分數為3%，上樣量為5 μL，電流為15 mA。結束后取出凝膠采用考馬斯亮藍R-250 染色1 h，然后用體積分數均為10%的甲醇和冰醋酸脫色。凝膠掃描利用Gel-Doc XR+凝膠成像儀。亞基含量計算采用Image Lab 軟件，并采用標準差與平均值的比值計算變異系數，量化比較不同品種的花生蛋白亞基含量間的差異性。

1.2.4 花生蛋白溶解性的測定

稱取粗提花生蛋白(含0.5 g蛋白)，將其分散到50 mL磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L、pH 7.0)中，攪拌2 h后，在5 000 r/min下離心30 min取上清。采用Lowry法測定上清液中花生蛋白含量，牛血清白蛋白為標準蛋白[10]。花生蛋白溶解性計算如式(2)所示。

花生蛋白溶解性=上清液質量×上清液中蛋白含量/樣品中蛋白質量×100%

(2)

1.2.5 花生蛋白乳化性的測定

將粗提花生蛋白分散于0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，分散液中花生蛋白質量濃度為1 g/L，取40 mL分散液并向其中加入10 mL花生油，10 000 r/min高速剪切1 min后迅速從底部吸取20 μL乳液，用1 g/L SDS稀釋至5 mL，在500 nm處測定吸光度。10 min后采用同樣操作測定吸光度。空白參照為1 g/L SDS溶液。花生蛋白乳化活性和乳化穩定性[11]計算如式(3)和式(4)所示。

(3)

(4)

式中：EAI為乳化活性，m2/g；ESI為乳化穩定性，min；N為乳液稀釋倍數；A0為0 min時的吸光度；At為10 min時的吸光度；φ為油相比例；C為初始蛋白質量濃度，g/mL。

1.2.6 花生蛋白起泡性的測定

參照Huang等[12]的方法并略有改動。將粗提花生蛋白分散于0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)中，分散液中花生蛋白質量濃度為1 g/L，取40 mL分散液于10 000 r/min高速剪切2 min，立即轉入100 mL量筒中，記錄樣品體積及靜置30 min后樣品體積。起泡能力和泡沫穩定性的計算如式(5)和式(6)所示。

(5)

(6)

式中：FC為起泡能力；FS為泡沫穩定性;V1為0 min量筒中樣品體積,mL；V2為30 min后量筒中樣品體積,mL。

1.2.7 花生蛋白持水性的測定

參照張曉蘭等[13]的方法。稱取粗提花生蛋白(含0.5 g蛋白)于離心管中，向其中加入10 g去離子水，混勻后靜置30 min，然后在3 000 r/min下離心10 min，去除上層未吸附澄清水。花生蛋白持水性計算如式(7)所示。

持水性=樣品吸水量/樣品中花生蛋白質量×100%

(7)

1.2.8 花生蛋白持油性的測定

參照張曉蘭等[13]的方法。稱取粗提花生蛋白(含0.5 g蛋白)于離心管中，向其中加入4 g花生油，混勻后靜置30 min，然后在3 000 r/min下離心10 min，去除上層未吸附油。花生蛋白持油性計算如式(8)所示。

持油性=樣品吸油量/樣品中花生蛋白質量×100%

(8)

1.2.9 數據統計分析

所有實驗均重復3次，數據表達取平均值，并使用SPSS Statistics 20 軟件對數據結果進行相關性分析，在p<0.05水平上顯著相關，在p<0.01水平上極顯著相關。

2 結果與討論

2.1 花生蛋白亞基分析

21個品種的花生蛋白和花生粕的SDS-PAGE圖譜如圖1所示。由圖1可知，花生蛋白主要由伴花生球蛋白Ⅱ(65.4 kDa)、花生球蛋白(42.1、40.5、36.8 kDa和18.8 kDa)和伴花生球蛋白Ⅰ(18.0、16.1 kDa和15.1 kDa)3個組分組成，且亞基出現位置與封小龍等[14]研究報道的較接近。除了上述亞基外，圖1中還有其他花生蛋白亞基(33.2、25.6、24.4 kDa)，條帶顏色較淺，與Zheng等[15]的研究結果一致。

注：M為標準蛋白；1～21分別對應表1中的花生品種編號。

由圖1(A)計算得到的花生蛋白亞基含量如表2所示，花生蛋白亞基含量變異系數見表3。由表2可知：構成花生蛋白的3個組分亞基含量較高；其他亞基(33.2、25.6 kDa和24.4 kDa)含量則較低，分別為(1.70±0.59)%、(1.61±0.43)%和(4.12±1.01)%。另外，花生蛋白亞基組成存在品種差異性。由表3可知，不同亞基的變異系數均在10%以上，其中15.1 kDa亞基含量差異性最大(變異系數為45.53%)，18.8 kDa亞基含量差異性最小(變異系數為11.87%)。研究表明植物蛋白的亞基組成及性質與功能性質有密切關系[16]。王麗[17]研究發現花生球蛋白23.5 kDa亞基(與本研究中的18.8 kDa亞基條帶出現位置接近)與花生蛋白溶解性有顯著相關性。

表2 21個品種的花生蛋白亞基含量

表3 21個品種的花生蛋白亞基含量的變異系數

由圖1(B)計算得到的花生粕亞基含量如表4所示。由表4可知，與花生粕亞基含量相比，提取的花生蛋白65.4、42.1 kDa和40.5 kDa亞基含量(見表2)下降， 16.1 kDa亞基含量明顯升高。Sheikh等[18]研究花生蛋白雙向電泳發現68 kDa亞基和43 kDa亞基等電點分別為6.3～7.3和5.5～6.3，15.5 kDa亞基的等電點為4.7～5.5。因此，65.4、42.1 kDa和40.5 kDa亞基很大程度受等電點偏離酸沉pH的影響(堿溶pH為11，強堿性環境能夠很好地溶解蛋白質)，在提取花生蛋白(堿溶酸沉)的過程中易損失。

表4 21個品種的花生粕亞基含量

2.2 花生蛋白提取率及功能性質分析

21個品種的花生蛋白提取率及功能性質見表5、變異系數見表6。由表5可知，花生蛋白提取率超過80%的有17個品種，其中大白沙的蛋白提取率最高，為93.89%，四粒紅的蛋白提取率最低，為71.96%。由表6可知，蛋白提取率的變異系數是7.41%，表明花生蛋白的提取率存在品種差異，這可能與不同花生品種的粗蛋白質含量有關。

從表5可以看出，花生蛋白溶解性為45.32%～78.92%，低于食品加工中常用的大豆蛋白的溶解性(>80%[19])。溶解性變異系數大于10%(見表6)，表明花生品種間的溶解性差異明顯。從表5、表6可看出：花生蛋白乳化活性變異系數為14.68%，變幅為34.31～58.50 m2/g，超過50 m2/g的有7個品種，其中冀花4號乳化活性最高(58.50 m2/g)；乳化穩定性變異系數為14.35%，變幅為13.54～23.76 min，超過20 min的僅有2個品種，其中魯花11的乳化穩定性最高(23.76 min)；起泡能力變異系數為16.62%，變幅為7.00%～14.00%，起泡能力超過10%的品種有7個，其中花育24的起泡能力最強，為14%；泡沫穩定性變異系數為7.60%，變幅為62.50%～85.71%，泡沫穩定性超過80%的品種有11個，其中花育24的泡沫穩定性最強(85.71%)；持水性變異系數為9.85%，變幅為1.89%～2.94%，其中花育24的持水性最好(2.94%)，其次是花育25(2.64%)和冀花2號(2.59%)；持油性變異系數為10.69%，變幅為1.10%～1.67%，其中四粒紅、國育2016和白沙的持水性最好(均為1.67%)，其次是拔二罐和天府3號(均為1.64%)。

表5 21個品種的花生蛋白提取率及功能性質

表6 21個品種的花生蛋白提取率及功能性質的變異系數 %

2.3 花生蛋白亞基與蛋白提取率及功能性質相關性分析

采用SPSS軟件對花生蛋白亞基與蛋白提取率及功能性質進行相關性分析，結果如表7所示。由表7可知，花生蛋白亞基與蛋白提取率、功能性質均存在相關性，其中16.1 kDa亞基與花生蛋白提取率呈極顯著正相關(p<0.01，r=0.559)，而65.4、42.1 kDa亞基和40.5 kDa亞基與花生蛋白提取率呈極顯著負相關(p<0.01，r=-0.706；r=-0.581，r=-0.621)。從2.1的研究結果可知，這可能與蛋白亞基等電點有關，蛋白中含有較多等電點接近酸沉pH(pH 4.5)的亞基時，則蛋白提取率較高，反之則蛋白提取率較低。33.2 kDa亞基與花生蛋白溶解性呈極顯著正相關(p<0.01，r=0.559)，而18.8 kDa亞基與花生蛋白溶解性呈顯著負相關(p<0.05，r=-0.541)，原因可能與蛋白亞基結構有關，研究發現疏松的亞基結構促進分子的伸展，有利于親水基團的暴露[20]，從而提高水溶性。24.4 kDa亞基與花生蛋白起泡能力呈極顯著負相關(p<0.01，r=-0.565)；42.1 kDa亞基與花生蛋白的持油性呈極顯著正相關(p<0.01，r=0.627)，這可能與亞基的疏水基團較多有關[21]。綜上可知，根據花生蛋白的亞基組成及含量可預示花生蛋白提取率及功能性質，從而為花生蛋白用于具體的食品體系時提供一定的理論基礎。

表7 花生蛋白亞基與蛋白提取率及功能性質的相關性分析

3 結 論

以21個品種花生為原料，測定花生蛋白亞基組成及蛋白提取率、功能性質，利用相關性分析指標間關系。結果表明：花生蛋白亞基含量對蛋白提取率及功能性質有明顯影響，65.4、42.1、40.5 kDa亞基和16.1 kDa亞基均與花生蛋白提取率呈極顯著相關(r=-0.706，r=-0.581，r=-0.621和r=0.559)；33.2 kDa亞基與花生蛋白溶解性呈極顯著正相關(r=0.559)，而18.8 kDa亞基與花生蛋白溶解性呈顯著負相關(r=-0.541)；24.4 kDa亞基與花生蛋白起泡能力呈極顯著負相關(r=-0.565)；42.1 kDa亞基與花生蛋白的持油性呈極顯著正相關(r=0.627)。