阿爾茨海默病和輕度認知障礙常用實驗動物模型的初步評價

于 蕾，賀曉麗

(中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京 100193)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種在老年人中發病率極高的神經系統退行性疾病，是繼癌癥、心血管疾病及腦卒中后致人類死亡的第四大病因。其癥狀往往隨著年齡的增長而惡化，從輕度記憶障礙逐漸發展為嚴重的癡呆，包括語言技能的喪失、認知缺陷、視覺空間功能障礙、執行功能喪失等。AD發生具有隱匿性，按照病情發展可以被分為：無癥狀臨床前期、輕度認知功能障礙期(mild cognitive impairment，MCI)和癡呆期。MCI診斷標準最早由美國精神科專家Petersen在1999年提出，其是指處于正常老化和癡呆的一種中間過渡狀態[1]。MCI具有轉化為AD的高度危險性，年轉化率為10%～15%，AD患者中有2/3由MCI轉化而來，是正常老年人的10倍[2-3]。目前，國際上還沒有特效AD治療藥物，如果能在MCI階段進行早期發現和有效干預，將可能會大大降低AD的發病率。

隨著對AD研究的深入，MCI逐漸成為基礎研究者的關注焦點。為了進行AD發病機制研究、藥物篩選以及新藥研發等，成功建立具有MCI特征的動物模型是必須的。但目前建立的MCI研究模型如何有效區別于AD模型仍存在著一定困難。故本綜述從AD和MCI的病理特征和診斷標準入手，通過介紹常用AD和MCI實驗動物模型的研究進展，從模型建立的角度對其進行總結和初步評價，為開展AD和MCI的研究提供建議。

1 AD與MCI的特征

關于AD的發病機制目前尚無定論，存在的假說有β-淀粉樣蛋白異常沉積、膽堿能損傷學說、Tau蛋白過度磷酸化、氧化應激、炎癥以及胰島素信號傳導通路障礙等，比較公認的是β-淀粉樣蛋白異常沉積、Tau蛋白過度磷酸化和膽堿能損傷學說[4]。研究表明[1]，MCI患者的Meynert基底核區膽堿能神經元無減少，而早期AD患者減少15%。此外，MRI結果發現，MCI患者的海馬和內嗅皮質的體積減少處于AD和正常老化之間，并且減少的速度高于正常老化人群[5]，MCI病人的海馬結構越小，AD轉化率越高[1]，因此通過MRI定量測量海馬萎縮，可預測MCI轉化為AD的危險性。通過VBM分析證實[6]，AD患者的灰質在海馬、海馬旁回、顳極、尾狀核頭、丘腦內側、腦島和杏仁核等部位發生退化，且左腦灰質體積萎縮更為顯著，而MCI患者始于顳葉與額葉的灰質萎縮，導致聽覺與記憶功能退化。

MCI作為AD的極早期階段，介于正常衰老與老年癡呆的過渡狀態，尚未達到癡呆程度，尸檢同樣發現大多數的AD和MCI患者的病理特征相似[7]，但是只在程度上有所區別。AD患者腦部萎縮更為嚴重，病變部位更多，主要表現為乙酰膽堿活性不足；AD患者認知功能為多領域受損，而MCI的認知功能損害可能只局限于一個或者幾個認知領域。結合MCI的病理表現，MCI動物模型的理想特征應為老年、輕微的記憶受損、輕度神經病理改變、膽堿能系統改變、以及腦血管改變等，至少出現上述兩種特征，即可以被合理地認為是MCI模型[8]。AD和MCI實驗動物模型之間的區分標準應包括模型動物發生認知障礙的年齡，以及認知損害的嚴重程度[3]。

2 動物模型及造模方法

AD和MCI動物模型按產生原因大致分為兩類：一是先天性動物模型，即動物本身所帶有的相關病變，如代謝紊亂或特定蛋白質合成障礙等，常用的有轉基因模型、基因敲除模型和快速老化小鼠等；二是后發性動物模型，人為介入物理、化學、生物等致病因素，誘發模型呈現部分或全部疾病特征，如膽堿能損傷模型、D-半乳糖模型、鋁中毒模型和Aβ側腦室注射模型等，本綜述主要討論后者。

2.1 常用AD動物模型

2.1.1膽堿能損傷模型 膽堿能神經遞質是參與學習和記憶最重要的神經遞質之一，乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)在中樞神經系統起著關鍵性作用，能特異性的作用于各類膽堿能受體。膽堿和乙酰輔酶A在ChAT的催化作用下合成ACh，進入突觸間隙的ACh作用于突觸后膜發揮生理作用后被AChE水解成膽堿和乙酸，從而終止膽堿能神經的信號傳遞，整個過程中AChE和ChAT共同維持ACh的含量和膽堿能系統的動態平衡。AD患者腦內膽堿能系統發生紊亂，ACh含量減少，是導致記憶力下降的主要原因。因此破壞動物腦內的膽堿能系統，可以重現AD膽堿能衰退的病理特征來制作AD動物模型。但該模型不出現老年斑和神經纖維纏結等AD的典型病理改變，因此多應用于膽堿能系統的機制研究及藥物評價。

2.1.1.1 東莨菪堿誘導膽堿能損傷模型 東莨菪堿是M型乙酰膽堿受體競爭性阻斷藥，能夠誘發中樞神經系統中的膽堿能神經通路及記憶環路的功能紊亂，從而導致學習記憶的嚴重損傷。由于東莨菪堿與突觸后膜M型乙酰膽堿受體的結合是可逆的，故其阻斷學習記憶的作用具有一過性特征。該模型通常采用KM、ICR或C57BL/6J小鼠，于行為學實驗前15 min或30 min腹腔注射東莨菪堿1～3 mg·kg-1[9-10]。少量文獻使用5 mg·kg-1劑量或0.2 mg·kg-1連續6 d。后進行跳臺、避暗、穿梭箱等實驗進行學習記憶行為學檢測，并進行病理學檢查，以評價模型是否成功。

2.1.1.2 基底前腦膽堿能神經元選擇性損傷模型 興奮性氨基酸主要存在于神經元的突觸末端及各種神經細胞的細胞體和膠質細胞的細胞質中，過量的興奮性氨基酸可能對神經細胞造成毒性作用。鵝膏蕈氨酸(Ibotenic acid，IBO)是一種含有異噁唑環的興奮性氨基酸，具有較強的神經毒性，其與神經細胞樹突上的N-甲基-D天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)受體相結合而作用于Ca2+通道，使大量Ca2+內流，造成膽堿能神經元損傷和功能喪失，引起學習記憶能力減退，乙酰膽堿含量降低以模擬AD。該模型采用SD雄性大鼠手術造模，腦部雙側注射鵝膏蕈氨酸，每側注射時間5 min，留針5 min，緩慢起針縫合切口并肌注適量慶大霉素。對照組(假手術組)注射等量PBS或生理鹽水。造模14 d后，通過行為學實驗及病理學檢查以確定模型是否成功[11-12]。

2.1.2Aβ損傷模型 AD的病理特征主要為腦內淀粉樣斑塊沉積、神經元丟失及神經纖維纏結形成。正常生理情況下人體中的β-淀粉樣前體蛋白降解均會產生少量的Aβ40和Aβ42，其以可溶性、低濃度形式存在于腦脊液和血漿中，并不會產生神經毒性。病理狀態下，Aβ42含量升高且Aβ42更易聚集形成淀粉樣蛋白，是形成老年斑的主要成分，提示它在AD發病機制中占有更重要的作用。Aβ誘導的AD動物模型，一般采用雄性ICR小鼠或雄性Wistar大鼠，將人工合成的Aβ在微滲透泵的推動下注射入動物的側腦室或海馬組織中，模擬Aβ對中樞神經的毒性[13-14]。

2.1.3岡田酸(OA)致Tau蛋白損傷模型 Tau蛋白屬于微管相關蛋白(MAPs)家族，于1975年被發現且被鑒定為細胞骨架中裝配和穩定微管的必需成分,主要存在于細胞軸突。Tau蛋白的錯誤折疊和病理改變是神經系統退行性疾病的基礎，高度磷酸化的Tau蛋白因為結構的改變可以形成寡聚體，寡聚體進一步形成具有雙螺旋紐帶結構的成對螺旋絲(PHFs)。PHFs進一步形成神經纖維纏結，從而導致突觸消失，認知能力下降。岡田酸是一種磷酸酯酶抑制劑，可以快速的代謝進而改變體內磷酸化-去磷酸化速率。通常采用Wistar雄性大鼠，向其側腦室微泵注入磷酸酯酶抑制劑，使磷酸化的Tau蛋白呈現雙螺旋細絲狀的病理改變，從而導致β-淀粉樣蛋白沉積和隨后的神經元變性、突觸損失和記憶障礙[15]。

2.1.4D-半乳糖(D-gal)模型 D-gal是人體中的一種還原性糖，可以在正常生理濃度下代謝為葡萄糖。但是在高濃度下，D-gal在醛糖還原酶的作用下生成半乳糖醇，半乳糖醇繼而被激活后的半乳糖脫氫酶氧化，生成氧化產物過氧化氫和醛，這一過程共產生3種活性氧自由基(ROS)，過量的ROS進一步攻擊細胞，引起神經元細胞的損傷，從而動物出現學習記憶障礙和機體衰老等特征。文獻報道[16]通過檢索1996～2007年CNKI和NCBI文獻，D-Gal致衰老模型鼠主要有KM、ICR或BALB/C小鼠，其中KM小鼠所占比例為0.797。D-Gal造模方法主要為頸背部皮下注射或腹腔注射，而頸背部皮下注射占比約為0.824。D-Gal常用濃度為50～500 mg·kg-1不等，其中100～150 mg·kg-1所占比例為0.488。我們通過NCBI篩查近5年英文文獻，發現模型鼠以昆明鼠、ICR、BALB/C居多，D-gal劑量在100～150 mg·kg-1造模時間為8～10周，而D-gal劑量在500 mg·kg-1造模時間為5～6周，給藥方式均為生理鹽水溶解后頸背部皮下注射[17-18]。

2.1.5鋁中毒模型 鋁是自然界分布極其廣泛的一種金屬，一般以化合態存在，有研究表明高水平的鋁會增加某些神經退行性疾病的風險，包括透析性腦病、AD和帕金森病(PD)等。動物實驗表明鋁會導致神經病理、神經行為、神經化學的改變從而導致記憶能力損傷。鋁中毒模型一般采用連續或間隔灌胃AlCl3溶液10～500 mg·kg-16～12周，大鼠通常使用Wistar大鼠，小鼠可使用KM或者ICR小鼠[19-20]。

2.2 常用MCI動物模型AD在臨床上治療效果不佳的主要原因之一是干預時機太晚，在診斷出癡呆時記憶已經發生不可逆轉性損害，同時伴隨有大量神經元凋亡。因此一些學者提出，應當把干預時間前移，即在MCI階段介入治療。對MCI的干預目的是為了預防、延緩甚至是扭轉其向AD轉化的進程。針對這一目的的干預措施分為：臨床手段和非臨床手段。而由于提出MCI這個概念時間尚短和其本身的不確定性，非臨床研究開展的較少。

以輕度認知障礙為主題詞合并關鍵詞動物在CNKI檢索，共有69條結果，有效文章5篇。以Mild cognitive impairment為主題詞合并Animal在NCBI檢索，共有72條結果，有效文章1篇。再以輕度認知障礙和Mild cognitive impairment分別在CNKI和NCBI對檢索結果進行復篩，發現動物輕度認知障礙模型主要包括姚明江等[21]以大鼠頸背部皮下連續5～10周注射D-半乳糖50 mg·kg-1，后高脂飼料喂養2～5周構建的老年輕度認知障礙模型。徐世軍等[22]使用KM小鼠，行為學實驗前30 min前腹腔注射東莨菪堿2 mg·kg-1造模。

在基礎研究方面，AD實驗動物模型有多種類型，MCI研究模型應區別于AD模型。原則上AD的動物模型在早期時，可以模擬輕度認知障礙，如已經報道的先天性動物模型，包括轉基因鼠和老化鼠等[3,23]。但是本文主要討論后發性動物模型，即上述由人為介入物理、化學、生物等致病因素而造成的模型。而以上實驗中報道的MCI模型無論是在造模周期、給藥劑量、還是給藥方式上與AD模型都沒有顯著的差異，同時在實驗中也沒有明確給出判斷為MCI的指標或標準。毋庸置疑的是在上述模型中一定存在MCI階段，但是在現階段還無法準確判斷其發生的具體時間。

3 評價

通過模型總結發現：膽堿能神經元選擇性損傷誘導的癡呆模型可以模擬人大腦皮層、海馬等腦區膽堿能神經系統損害和記憶認知行為的改變，造模時間短，價格便宜，但該模型存在一定的弊端：東莨菪堿引起的膽堿能功能損害是可逆的，具有一過性特征；IBO所誘導的癡呆僅模擬了與認知功能有關的膽堿能神經系統損害相關的信息，并有可能損害鄰近注射部位的非膽堿能神經元。Aβ/岡田酸注射模型模擬了癡呆的認知功能障礙和某些病理改變，具有操作簡單、時程短、成本低等優點，適用于抗癡呆藥物篩選研究。但應注意在腦部導入Aβ/岡田酸的同時動物都有一定的局灶型損傷，且大量Aβ或岡田酸彌散分布到腦是該模型所需要解決的問題，并且動物體內存在Aβ清除機制，因此模型很難達到滿意的效果。另外，腦內注射Aβ/岡田酸是一種急性單因素模型，不符合AD慢性起病的特點。D-gal致衰老模型在造模過程中表現出接近自然老化的生理特點，出現學習與記憶能力減退、海馬錐體細胞減少、病理細胞增多等現象。又因為其價格低、操作方便、重復性高等特點，廣泛用于AD和MCI的D-gal致衰老模型，同時也可以與其他造模方式聯合起來制作需要的模型。但其對氧化機制的闡釋與AD經典病理特征的呈現仍有不足。鋁損傷模型模擬了AD膽堿能神經系統功能下降及記憶力減退的特征，但此模型形成的神經纖維纏結中Tau蛋白沒有磷酸化成PHF，中樞膽堿能活性正常，而且造模周期較長。

現今已經有很多實驗室采用復合方法造模。羅煥敏等[24]采用D-gal合并AlCl3成功制備符合發病特征的AD模型；曾芳等[25]在腹腔注射D-gal的基礎上，采用側腦室注射Aβ，該模型體現了Aβ沉積和記憶功能損害等AD主要的病理學特征。采用復合多因素模型，更符合癡呆病癥的多靶點特征，有可能在抗癡呆領域得到更為廣泛的應用。

對于AD或者MCI，臨床診斷方法包括生物標志物檢測、神經心理學評估量表、基因檢測、影像學檢查等，并分別制定了詳細的診斷和治療指南。在基礎研究方面，由于動物實驗的局限性以及可行性問題，即使每年發表大量AD的研究文章，但是缺少明確的評價指標來判斷究竟模型是AD模型還是MCI模型。所以在已發表文章中針對基礎研究的MCI階段，存在兩個疑慮，其一：MCI模型是否造模成功；其二：如何認定所建立的模型是AD還是MCI模型。

4 結語

AD由于其疾病本身的復雜性，單一造模存在很大弊端，越來越多的研究趨向于復合造模，目前為止，尚無對復合造模效果的比較研究，由于AD和MCI的發病機制不夠明確，且猜想靶點和致病因素較多，世界范圍內目前未發現能夠全面再現人AD、MCI病理特征的動物模型。但多數學者認為，采用復合方法造模能在很大程度上表現出更為接近AD或MCI特征的模型動物，為癡呆的研究提出了更深入的探索方向。迄今為止沒有公認的AD或MCI動物模型，研究者只能從藥物和疾病本身的特征出發，選擇匹配度較高的模型用于研究。一般而言，基礎研究的藥效評價多數依賴于動物指標，所以模型的選擇、模型成功與否、能否精準造模以符合疾病特征等是實驗過程中我們需要慎重考慮的問題。

致謝：本綜述在中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所完成，指導老師賀曉麗老師。