以脯氨酸作為連接臂的聚乙二醇齊墩果酸衍生物的合成

宋艷玲， 仝瑞杰， 杜新春

(沈陽化工大學制藥與生物工程學院， 遼寧 沈陽 110142)

聚乙二醇(PEG)和氨基酸修飾的方法可以用于中藥難溶性有效成分前藥的合成[1-3].PEG作為一種無毒且生物相容性好的藥物載體具有顯著的增溶作用，能夠延長藥物在體內半衰期，改善藥物的生物利用度.氨基酸修飾不僅可以改善藥物的溶解度，還能夠增加藥物對腫瘤細胞的靶向性和抗腫瘤活性，且能夠降低藥物對機體正常細胞的毒副作用.

齊墩果酸(Oleanolic Acid，OA，見圖1)作為五環三萜類化合物的典型代表，具有顯著的抗腫瘤、抗炎、抗氧化和抗血小板聚集等藥理活性.但齊墩果酸的水溶性非常差，限制了其臨床應用[4-5].為增加其溶解性及生物利用度，本文采用單甲氧基聚乙二醇5000(mPEG5000)與L-脯氨酸(L-Proline，L-Pro)反應得到mPEG-Pro衍生物[6-7]，再利用氨基酸末端的羧基與齊墩果酸C3-位的羥基發生酯化反應得到目標產物PEG-Pro-OA.通過色譜法對目標產物的水溶性進行測試，并通過目標產物對肝癌HepG2細胞的體外抑制活性，考察其抗癌活性.

圖1 齊墩果酸的立體化學結構Fig.1 Stereochemical structure of oleanolic acid

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ARX-300核磁共振儀，美國Bruker公司；IR-435紅外光譜測定儀，KBr壓片法，日本島津公司；Büchi B-540熔點測定儀，瑞士Büchi公司，溫度未經校正；RT6100酶標儀，美國雷杜公司.

齊墩果酸，蘭州沃特斯公司；聚乙二醇，國藥集團化學試劑有限公司；L-脯氨酸，上海吉爾生化公司；HepG2，中科院上海細胞研究所；RPMI 1640培養基，美國Gibco公司；新生牛血清，杭州四季青公司；其他試劑均為市售分析純.

1.2 合成實驗

PEG-Pro-OA衍生物的合成路線如下：

1.2.1 單甲氧聚乙二醇5000對甲苯磺酸酯(mPEG5000-OTs，化合物1)的制備

將mPEG5000(50.0 g，10 mmol)溶于50 mL無水丙酮中，室溫攪拌下滴加三乙胺(20 mL，144 mmol)，將溶于5 mL無水丙酮中的對甲苯磺酰氯(20.0 g，64 mmol)滴加至上述溶液中，室溫反應過夜.反應結束后過濾，將濾液濃縮至原溶液體積的1/10后逐滴加入至500 mL無水乙醚中，析出固體，過濾，干燥，得白色固體mPEG5000-OTs (42.4 g，收率85 %).

1.2.2 單甲氧聚乙二醇5000-脯氨酸(mPEG5000-Pro，化合物2)的制備

將mPEG5000-OTs(20.0 g，4 mmol)溶于200 mL DMF中，加入脯氨酸(3.8 g，20 mmol)的碳酸氫鈉溶液(1 mol/L，20 mL)，回流反應12 h.反應結束后過濾，除去不溶物，5 mol/L鹽酸調濾液pH至3，CH2Cl2萃取(100 mL×3)，合并萃取液，水洗，無水Na2SO4干燥，過濾，將濾液濃縮至原溶液體積的1/10后逐滴加入至200 mL無水乙醚中，析出固體，過濾，干燥，得白色固體(11.5 g，收率58.0 %).mp:53.5～59.5 ℃；IR(KBr)，σ/cm-1:3 450,2 890,1 734,1 465,1 345,1 285,1 118,850.

1.2.3 單甲氧聚乙二醇5000-脯氨酸酰氯(化合物3)的制備

將化合物2(10.0 g，2.0 mmol)溶于100 mL無水二氯甲烷中，加熱至40 ℃，攪拌下緩慢滴加草酰氯(1.7 mL，20.0 mmol)，回流反應2 h.反應完全后，減壓蒸干溶劑，加入2次環己烷，每次50 mL，減壓蒸干得淺棕色固體粉末，直接用于下步反應.

1.2.4 單甲氧聚乙二醇5000-脯氨酸-齊墩果酸復合物(化合物4)的制備

將上述所得化合物3和齊墩果酸 0.91 g(2.0 mmol)溶于100 mL二氯甲烷中，加入2.8 mL三乙胺為縛酸劑，室溫反應24 h.反應完畢后過濾，濾液水洗2次，無水Na2SO4干燥，過濾，將濾液濃縮至原溶液體積的1/10后逐滴加入至200 mL無水乙醚中，析出固體，過濾，干燥，得到白色固體產物(0.38 g，收率75 %).mp：56.5～62.6 ℃；IR(KBr)，σ/cm-1:3 480,1 732,1 640,1 570,1 400,1 106.1H-NMR(300 MHz,CDCl3)，δ:0.81(s,CH3,3H),0.91(s,CH3,3H),0.92(s,CH3,3H),1.05(s,2CH3,6H),1.09(s,CH3,3H),1.17(s,CH3,3H),1.59～1.65 (m,2H),2.05～2.11 (m,2H),2.37～2.42 (m,1H),2.55～2.70 (m,4H),3.29～3.36(m,2H),3.42(s,3H),3.64～4.15(m,446H),4.42 (brs,H-3,1H),5.40～5.52 (m,H-12,1H).

1.3 水溶性測試

采用平衡法，通過高效液相色譜儀測定齊墩果酸及聚乙二醇化的齊墩果酸衍生物的溶解度.分別將過量的OA和mPEG5000-Pro-OA加到10 mL水中，將兩種混懸液置于振蕩器內，在25 ℃恒溫條件下振搖24 h，停止振搖后繼續靜置2 h.此時上清液濃度達到平衡，用0.50 μm微孔濾膜過濾，取濾液，稀釋10倍后用高效液相色譜法測定溶液濃度，計算溶解度，結果見表1.

表1 OA和mPEG5000-Pro-OA化合物水溶性及對HepG2細胞的抑制活性Table 1 Water solubility of OA and mPEG5000-Pro-OA compounds and their inhibitory activity on HepG2 cells

注：*為化合物質量濃度為50 mg/L經過48 h處理后的細胞抑制率.

1.4 生物活性測試

采用MTT法檢測OA和mPEG5000-Pro-OA對肝癌HepG2細胞增殖的作用.HepG2細胞用RPMI1640培養液在37 ℃、質量分數5 %的CO2飽和濕度條件下培養至細胞數為2×104～4×104個/mL.以每孔200 μL接種于96孔培養板中，分別加入質量濃度為500 mg/L、50 mg/L、5 mg/L的OA和mPEG5000-Pro-OA，同時設置對照組和空白組，每組均設3個復孔，培養24 h、48 h.繼續放置 37 ℃、5 %的CO2及飽和濕度溫箱中培養，72 h后棄培養液，每孔加入20 μL (5 g/L)新鮮配制的MTT溶液，在37 ℃下繼續孵育4 h，棄上清液，并向每孔加入100 μL/孔DMSO溶解甲臜顆粒，微量振蕩儀上振蕩5 min溶解.用酶標儀在波長490 nm下測各孔的光密度(OD)值，并記錄數據.計算所測化合物對細胞的抑制率及IC50.實驗重復3次，結果取平均值，實驗結果如表1所示.按下列公式計算藥物對腫瘤細胞體外增殖的抑制率(Inhibition Rate，IR)：

用IC50計算軟件計算半數抑制濃度(IC50).

2 結果與討論

聚乙二醇分子質量過小可能導致水溶性改善不顯著，若分子質量過大可能會影響齊墩果酸的載藥量.因此實驗選用mPEG5000，利用脯氨酸的氨基和羧基作為連接臂將mPEG結合到齊墩果酸C-3位羥基上.以單聚乙二醇為起始原料，通過羥基對甲苯磺酰化反應、氨化反應、酰氯化反應和酯化反應，得到目標產物( mPEG-Pro-OA)，反應總收率約為37 %.通過高效液相色譜儀對齊墩果酸及聚乙二醇化的齊墩果酸衍生物的溶解度進行測定.采用MTT法檢測OA和mPEG5000-Pro-OA對肝癌HepG2細胞增殖的作用，初步考察目標產物的體外抗腫瘤活性.OA和mPEG5000-Pro-OA的水溶性及生物活性測試結果如表1所示.由表1結果可以看出：mPEG5000-Pro-OA的水溶性與原藥OA對比增加了5 000倍，可見聚乙二醇和氨基酸修飾化具有顯著的增溶效果；mPEG5000-Pro-OA對肝癌HepG2細胞的抑制作用強于原藥OA.

3 結 論

目前，大量氨基酸衍生物的抗腫瘤作用已被證實[8]，聚乙二醇在中藥難溶性小分子修飾方面也取得了巨大進展.本文在此設計思想下設計并制備了一種全新的聚乙二醇-氨基酸-齊墩果酸衍生物(mPEG5000-Pro-OA).研究結果表明：通過在OA結構中引入氨基酸和聚乙二醇片段，有利于提高其水溶性和體外抗腫瘤活性，其作用機理有待于進一步研究.該研究可為齊墩果酸聚乙二醇化前藥的合理設計提供理論基礎.