雄甾-3β,5α,6β-三醇衍生物的體外抗癌活性研究

劉躍金， 陳佳佳， 于春影

(1.沈陽化工大學 制藥與生物工程學院， 遼寧 沈陽 110142； 2.江蘇豪森藥業股份有限公司， 江蘇 連云港 224200)

2004年[1]和2006[2]年劉躍金等報道了3β,5α,6β-三羥基膽-24-酸甲酯等對L1210小鼠白血病細胞有一定體外抗癌活性.2008年劉躍金等[3]報道了3β,5α,6β-三羥基膽-24-酸甲酯、膽甾-3β,5α,6β-三醇等對小鼠S180肉瘤也有一定的體內抗癌活性.2011年Carvalho等[4]報道了膽甾-3β,4β,5α,6β-四醇、6β-甲氧基膽甾-3β,5α-二醇等化合物對HT-29等7個瘤株具有較好體外抗癌活性.2013年Wang等[5]報道了從中國南海柳珊瑚Menellakanisa中分離得到的膽甾-3β,5α,6β-三醇、麥角甾-3β,5α,6β-三醇等對A549人肺癌和MG-63人膀胱癌表現出較好的抗癌活性.同年Liu等[6]從中國南海柳珊瑚Muriceopsisflavida中得到的膽甾-1β,3β,5α,6β-四醇對A549人肺癌和人膀胱癌MG-63表現出較好的抗癌活性，膽甾-1β,3β,5α,6β-四醇和膽甾-3β,5α,6β-三醇能誘導A549細胞凋亡；謝珊珊等[7]報道膽甾-3β,5α,6β-三醇能誘導C6和A172神經膠質瘤細胞凋亡；Lin等[8]報道膽甾-3β,5α,6β-三醇能夠減弱PC-3前列腺癌細胞和DU-145前列腺癌細胞FAK信號通路和PI-3K-Akt信號通路，使其增殖受到抑制.2017年劉躍金等[9]報道了一些雄甾-3β,5α,6β-三醇衍生物對BEL-7402人肝癌細胞的抗癌活性，其中24,24-二甲基膽-3β,5α,6β,20-四醇的抗癌活性較好.腎上腺嗜鉻細胞瘤是比較兇險的惡性腫瘤，單獨的化療藥物療效不佳，目前臨床上常采用環磷酰胺、長春新堿、甲氮咪胺等聯合進行化療，但仍不理想.為了探索具有更好療效的抗癌藥物，本文以PC-12大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤為模型對7個雄甾-3β,5α,6β-三醇衍生物進行體外篩選.

1 材料與儀器

雄甾-3β,5α,6β-三醇衍生物： 3β,5α,6β-三羥基雄甾-17β-羧酸乙酯(O1)、3β,5α,6β-三羥基雄甾-17β-羧酸丁酯(O2)、20-乙基孕甾-3β,5α,6β,20-四醇(O3)、24,24-二甲基膽-3β,5α,6β,20-四醇(O4)、3β,5α,6β-三羥基孕甾-20-肟(O5)、3β,5α,6β-三羥基雄甾-17-酮(O6)、異螺甾-3β,5α,6β-三醇(O7)，質量分數皆≥99 %，自制，其結構式見圖1；PC-12大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞，中國科學院上海生科院細胞資源中心；四季青小牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司；RPMI1640培養基，美國Gibco公司；其他試劑，分析純，天津市博迪化工有限公司.

INC02-108 CO2培養箱，德國Memmert公司；北京普郎DNM-9602G酶標儀，北京儀和方圓科技有限公司.

圖1 雄甾-3β,5α,6β-三醇衍生物O1～O7的結構式Fig.1 Structural formula of androstan-3α,5β,6β- triol derivatives O1～O7

2 PC-12大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞體外增殖抑制實驗

取對數生長期的PC-12大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞，經消化、離心，以質量分數10 %的小牛血清RPMI1640培養液稀釋，調整細胞濃度為每升1×106個懸浮細胞.以每孔100 μL接種于96孔板，置于37 ℃、CO2體積分數為5 %的培養箱中培養24 h.精確稱樣，用二甲基亞砜(DMSO)助溶，加PBS(-)稀釋，每孔樣品的最終質量濃度分別為1.563 mg·L-1、3.125 mg·L-1、6.25 mg·L-1、12.5 mg·L-1、25 mg·L-1、50 mg·L-1和75 mg·L-1，每組12孔，培養20 h.每孔加20 μL質量濃度為5 mg·L-1的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基-2-H-四氮唑溴鹽(MTT)后繼續培養4 h.清除培養液，每孔再加150 μL 的DMSO，振蕩10 min.用酶標儀在570 nm 測定各孔吸光度.

抑制率=(1-加藥組吸光度值/對照組吸光度值)×100 %.

3 實驗結果

O1、O5和O7對PC-12大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞沒有抑制作用，O2、O3、O4和O6對PC-12大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞有抑制作用.

以樣品濃度為橫坐標、細胞抑制率為縱坐標，繪制O2、O3、O4和O6濃度-細胞抑制率曲線，如圖2～圖5所示.計算IC50值，結果見表1.

腎上腺嗜鉻細胞瘤是起源于腎上腺髓質嗜鉻細胞的腫瘤，這種瘤細胞能合成、分泌腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺，統稱兒茶酚胺類激素.兒茶酚胺類激素能引起小動脈收縮，導致血壓升高，有時突發分泌的大量兒茶酚胺可能引起高血壓危象.腎上腺嗜鉻細胞瘤一旦確診，應及時切除腫瘤，手術切除是首選的治療手段.有10 % 的嗜鉻細胞瘤為惡性嗜鉻細胞瘤，與其他惡性腫瘤不同的是病理活檢并不能判定出是良性還是惡性，只能通過嗜鉻細胞瘤是否發生轉移來判定是否為惡性，而一旦發生轉移，手術就會失去意義，化療、放療成為首選.可以聯合應用環磷酰胺、長春新堿、甲氮咪胺進行化療，但療效不佳.因此,以PC-12大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞篩選新的抗癌藥物具有現實意義.

圖2 O2對PC-12大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤 細胞增殖抑制率曲線Fig.2 The proliferation inhibition rate curve of O2 on PC-12 rat adrenal pheochromocytoma cell

圖3 O3對PC-12大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤 細胞增殖抑制率曲線Fig.3 The proliferation inhibition rate curve of O3 on PC-12 rat adrenal pheochromocytoma cell

圖4 O4對PC-12大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤 細胞增殖抑制率曲線Fig.4 The proliferation inhibition rate curve of O4 on PC-12 rat adrenal pheochromocytoma cell

圖5 O6對PC-12大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤 細胞增殖抑制率曲線Fig.5 The proliferation inhibition rate curve of O6 on PC-12 rat adrenal pheochromocytoma cell

表1 雄甾-3β,5α,6β-三醇衍生物O1～O7對PC-12 大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞的體外IC50Table 1 IC50 of androstan-3α,5β,6β-triol derivatives O1～ O7 on PC-12 rat adrenal pheochromocytoma cell line in vitro

注：“-”表示無活性；“+”表示有一定的抗癌活性，但抑制率<50 %.

4 討論與結論

本文實驗通過MTT活細胞染色法對7個雄甾-3β,5α,6β-三醇衍生物進行了PC-12大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞增殖抑制篩選，其內容未見文獻報道.其中：3β,5α,6β-三羥基雄甾-17β-羧酸丁酯(O2)、20-乙基孕甾-3β,5α,6β,20-四醇(O3)、24,24-二甲基膽-3β,5α,6β,20-四醇(O4)和3β,5α,6β-三羥基雄甾-17-酮(O6)有一定的抗癌活性.與文獻[9] 的報道比較，說明這4個化合物對BEL-7402人肝癌細胞和腎上腺嗜鉻細胞瘤作用相似，進一步肯定了抗癌作用.另外與之相似的化合物也有其他瘤株的篩選，如文獻[1-3]對L1210小鼠白血病細胞也有一定體外抗癌活性.到目前為止，這類化合物的瘤株種類篩選比較少，需要進一步擴大抗癌篩選譜，選出比較敏感的瘤株.3β,5α,6β-三羥基雄甾衍生物的抗癌活性值得進一步研究.