慢性心衰患者穩定期Bax、Bcl-2水平及其與心功能的關系

劉文秀，蘇 暢，白素芬，齊書英，汝磊生

聯勤保障部隊第九八〇醫院1心內科，2心胸外科，河北 石家莊 050082；3華北理工大學中醫學院中西醫臨床系，河北 唐山 063210

心衰是一組復雜的臨床綜合征，是全球病死率最高、住院率最高的疾病[1]。慢性心衰（CHF）的機制復雜，且不十分明確。心肌細胞凋亡是主要機制之一，人和動物模型都提示凋亡與心衰有關，且凋亡參與從心肌肥大到心衰的發展[2]。B淋巴瘤-2（Bcl-2）家族是一個參與凋亡和抗凋亡的大家族，Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，而Bcl-2相關X蛋白（Bax）是促細胞死亡的蛋白，是細胞死亡的負調節因子。多項動物實驗和臨床研究證實，Bcl-2和Bax參與慢性心衰的發展。目前關于Bcl-2和Bax在心肌細胞凋亡方面的研究較少，未見到有關慢性心衰穩定期患者循環炎癥細胞中Bcl-2和Bax水平的研究，且Bcl-2和Bax水平與心功能的關系未知。本研究對CHF穩定期患者循環炎癥細胞中Bcl-2和Bax水平進行報道，并分析Bcl-2和Bax水平與心功能的關系，幫助認識心衰的發病機制，對心衰的基因治療提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究納入60例2014年3月～2016年12月在我院心內科住院的穩定期CHF患者，包括32例男性和28例女性，年齡53～72歲（63.4±6.2歲）。60例患者中，28例為冠心病（CHD）心衰（有心肌梗死和/或冠狀動脈狹窄病史），15例為高血壓性心臟病（HHD）心衰（有明確的高血壓病史，排除冠狀動脈狹窄、瓣膜病等），17例為心肌病（CM，多為原發性心肌病）心衰（無明確的高血壓病、冠心病、瓣膜病、先天性心臟病等）。CHF組給予常規心衰治療。對照組納入30例健康人，均為來院門診健康體檢者，無心臟疾病，包括16例男性和14例女性，年齡49～70歲（60.7±6.1歲）。

1.2 選擇標準

1.2.1 納入標準 病例組由心臟病專家根據病史、體格檢查、心臟超聲、胸片、冠脈造影等檢查確診，心臟彩色多普勒超聲LVEF均＜45%（根據2007中國慢性心力衰竭診斷治療指南），為美國心臟病學會/協會心功能C期，或紐約心臟病協會心功能Ⅰ～Ⅳ級，經治療后心功能穩定至少1月入組。

1.2.2 排除標準 嚴重的肝腎功能異常；感染；惡性腫瘤患者；電解質紊亂；精神疾病；使用抗生素者；使用肝素者；急性心肌梗死；懷孕或哺乳期。本研究經醫院倫理學委員會批準同意執行。

1.3 定量反轉錄定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測Bcl-2和Bax mRNA的表達

晨起快速收集所有病例的靜脈血，用Ficoll-Paque PLUS淋巴細胞分離液分離外周血單核細胞（PBMC）。PBMC在加入10% FBS的RPMI-1640細胞培養基中培養2 h（37 ℃，5% CO2）。移除細胞懸液，PBMC即附著于培養基壁上生長，直至長滿。每24 h更換培養液。

以TRIzol試劑消化并收集，供提取所有RNA；再通過反轉錄合成cDNA，用來做qRT-PCR的模板，條件如下：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s 90次，54 ℃ 30 s，72 ℃1 min。GAPDH用來做內參。

1.4 測量左室射血分數（LVEF）

LVEF由經胸彩色多普勒超聲HP SONOS5500系統（飛利浦，荷蘭阿姆斯特丹）測定。

1.5 統計學方法

所有數據以SPSS 21.0和Graphpad Prism 5 for Windows軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，正態性檢驗采用D’Agostino & Pearson omnibus檢驗，方差齊性檢驗采用Levene法檢驗；兩組間比較采用均數間比較t檢驗；多組間均數比較采用單因素方差分析；多組間均數兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗；不符合正態分布或方差不齊時，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗；多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗；計數資料以百分數和例數表示，計數資料多個樣本率的比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson相關檢驗；方差不齊或等級資料相關性分析采用Spearman秩相關檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料結果

根據病因將CHF組分為3個亞組：CHD組、HHD組和CM組。CHD組年齡高于HHD組和CM組（P＜0.05）。CHD組吸煙比例高于HHD和CM組（P＜0.01）。HHD組高血壓病比例高于CHD組，CHD組高于CM組（P＜0.01）。CHD組糖尿病比例高于HHD組（P＜0.05），HHD組高于CM組（P＜0.01）。CHD組使用阿司匹林比例高于HHD和CM組（P＜0.01）。CHD組使用他汀類藥物比例高于HHD組（P＜0.01），HHD組高于CM組（P＜0.01）。CHF組LVEF低于對照組（P＜0.01）。CHF組N-末端B型鈉尿肽前體（NT-proBNP）、左室舒張末期內徑（LVEDD）、左房內徑、右室舒張期橫徑值高于對照組（P＜0.01，表1）。

2.2 CHF組和對照組Bcl-2和Bax mRNA水平的比較

CHF組外周血單核細胞Bcl-2 mRNA水平低于對照組（P＜0.01，圖1A）；Bax mRNA水平高于對照組（P＜0.01，圖1B）。

2.3 CHF 3個亞組Bcl-2和Bax mRNA水平的比較

3個亞組分別與對照組相比，外周血單核細胞Bcl-2和Bax mRNA水平的差異均有統計學意義（P＜0.01，圖2A）。組內兩兩比較，Bcl-2和Bax mRNA水平差異無統計學意義（P＞0.05，圖2B）。

2.4 Bcl-2、Bax mRNA水平與NHYA心功能分級的相關性

CHF組外周血單核細胞Bcl-2 mRNA的水平與NYHA心功能分級呈負相關（rs=-0.494,P=0.039，圖3），Bax mRNA的水平與NYHA心功能分級呈正相關（rs=0.536,P=0.041）。

2.5 Bcl-2、Bax mRNA水平與LVEF的相關性

CHF組外周血單核細胞Bcl-2 mRNA水平與LVEF呈正相關（r=0.497,P=0.035，圖4），Bax mRNA水平與LVEF呈負相關（r=-0.446,P=0.043）。

2.6 Bcl-2、Bax mRNA水平與NT-proBNP濃度的相關性

CHF組外周血單核細胞Bax mRNA水平與NT-proBNP濃度呈正相關（r=0.374,P=0.003，圖5）。Bcl-2 mRNA水平與NT-proBNP濃度無相關性（r=-0.227,P=0.082）。

表1 研究對象一般臨床資料

圖1 CHF組和對照組Bcl-2和Bax mRNA水平的比較

圖2 CHF 3個亞組Bcl-2和Bax mRNA水平的比較

圖3 Bcl-2、Bax mRNA水平與NHYA心功能分級的相關性

圖4 Bcl-2、Bax mRNA水平與LVEF的相關性

2.7 Bcl-2、Bax mRNA水平與LVEDD的相關性

CHF組外周血單核細胞Bax mRNA水平與LVEDD呈正相關（r=0.289,P=0.025，圖6），Bcl-2 mRNA水平與LVEDD無相關性（r=-0.168,P=0.201）。

圖5 Bcl-2、Bax mRNA水平與NT-proBNP濃度的相關性

圖6 Bcl-2、Bax mRNA水平與LVEDD的相關性

3 討論

凋亡導致逐漸丟失的心肌細胞加速了疾病的進程[3]。在射血分數降低的心衰中，心肌細胞凋亡在左室功能障礙的發展中起重要作用，且射血分數降低的心衰心肌細胞丟失是一個明確的特點[4-5]。細胞的命運大部分程度由促和抗凋亡因素表達的相對水平決定。Bcl-2家族中的Bcl-2是最主要的一種抗凋亡蛋白，而Bax是促細胞死亡的蛋白，是細胞死亡的負調節因子[6]，Bcl-2通過阻止Bax釋放細胞色素C對其抑制作用[7]。Bax阻止細胞凋亡主要依賴于Bcl-2和Bax的比值。當Bcl-2過剩時，Bax/Bcl-2二聚體形成，細胞受保護。然而，當Bax占多數時，Bax二聚體形成，細胞將啟動程序性細胞死亡。Bax還可能參與通道形成，減緩心衰進程[8]。

小鼠動物模型試驗表明，慢性缺氧、牽拉和長期壓力過重引起的心衰鼠心臟細胞凋亡明顯增加，Bax水平明顯升高，Bcl-2水平明顯降低。在試驗中，Bax基因的表達可以增加心臟壓力負荷過重時Bcl-2的表達[9]。升高的Bax可能通過加速電壓依賴性離子通道來調節細胞色素C從線粒體釋放[10]。國內的研究表明，與對照組相比，心衰模型小鼠心肌細胞凋亡明顯增加，Bax凋亡指數明顯升高，Bcl-2凋亡指數明顯降低，心肌細胞Bax/Bcl-2比值顯著升高[11]。在Bcl-2基因轉導的心衰小鼠模型中，6周后可見心肌細胞凋亡減少，心室重構改善[12]。但目前對于Bcl-2和Bax在CHF穩定期患者中mRNA水平的臨床研究很少，且有不一致的結論。研究報道缺血性心肌病和擴張型心肌病終末期心衰患者心肌組織Bax和Bcl-2表達均增加，缺血性心肌病組更明顯[13]。且Bax/Bcl-2參與心衰的機制仍不明確。動物實驗表明，Bax缺失不能使Ku70基因敲除的小鼠的心功能恢復正常，提示Ku70蛋白作為雙鏈DNA修復、復制、轉錄調控的關鍵核蛋白，Bax可能通過與Ku70基因的相互作用來導致心功能惡化[14]。另有動物實驗證實，Bax表達的增加和其與VDAC（電壓依賴性陰離子通道）的相互作用可導致線粒體的tRNA突變，加重心臟損害[15]。臨床研究表明，Bax基因的過甲基化可能參與增加70歲以上人群冠心病的風險[16]。

PBMC為多能髓系祖細胞，在特定條件下可分化為血細胞、心肌源性細胞和內皮細胞[17]。體外實驗也證實，移植到心梗小鼠和兔模型上時，人PBMC可分化為心肌細胞、血管內皮細胞和平滑肌細胞，參與缺血心臟再生[18]。最新的研究表明，高分化人心肌細胞可由PBMC起源的多能干細胞分化而來[19]。人的心肌細胞獲取困難，對PBMC凋亡相關基因的研究，可從一定程度上反映心肌細胞凋亡相關基因的功能。

本研究顯示，CHF組外周血單核細胞Bcl-2 mRNA水平低于對照組；Bax mRNA水平高于對照組。與心衰動物試驗中Bcl-2表達降低，Bax表達增加的趨勢一致；與Bcl-2凋亡指數降低，Bax凋亡指數升高的趨勢亦一致，表明CHF穩定期患者外周血單核細胞的Bcl-2和Bax mRNA水平與心肌細胞Bcl-2和Bax表達水平同步。CHF時Bcl-2和Bax表達的改變，增加了心肌細胞對凋亡的易感性，加重心衰的進展，進一步證明在CHF的發展過程中，心肌細胞凋亡起到了一定作用，發生凋亡的機制與Bcl-2和Bax水平的改變有關。Bcl-2和Bax mRNA表達水平3個亞組中的兩兩比較，無統計學差異。CHF組外周血單核細胞Bcl-2 mRNA水平與NYHA心功能分級呈負相關，與LVEF呈正相關；Bax mRNA水平與NYHA心功能分級呈正相關，與LVEF呈負相關。Bax mRNA水平還與NT-proBNP濃度和LVEDD呈正相關。Bcl-2 mRNA水平與NT-proBNP濃度和LVEDD的相關性未達到統計學意義，但有正相關的趨勢，可能與樣本量較小有關。

總之，Bcl-2和Bax這一對凋亡相關基因在慢性心衰穩定期表達發生明顯變化，各種病因所致的CHF可能導致這一對凋亡相關基因共同的改變，且mRNA水平與CHF病情嚴重程度相關，可能成為CHF預后因子之一。本研究未統計合并房顫的心衰患者，但已有研究表明，Bcl-2/Bax表達失衡可能參與房顫的發生發展[20]。可在后續的工作中對其進一步研究。