EFNA3在結(jié)直腸癌中的表達及臨床意義

段 潔，何藝偉，謝 明，楊 沙，陳賢永，周 君，曹慧秋

湘南學院12015級臨床醫(yī)學系，2基礎(chǔ)醫(yī)學院，3病理研究所，4附屬醫(yī)院病理科，湖南 郴州 423000；5郴州市第一人民醫(yī)院中心醫(yī)院病理科，湖南 郴州 423000

結(jié)直腸癌為世界上常見的消化道惡性腫瘤之一，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率與死亡率呈逐年升高的趨勢[1-3]。結(jié)直腸癌容易發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移和腫瘤化療藥物耐藥，預后差[4]。在直腸及直腸與乙狀結(jié)腸交界處發(fā)病率占60%的比例[5]。Eph家族蛋白包括促紅細胞生成素產(chǎn)生肝細胞受體（Eph）[6]及其細胞表面的配體Ephrin。Ephrin A3（EFNA3）為Eph家族成員之一，是抑制血管再生基因[7]，Eph及Ephrin均屬于膜蛋白，細胞間近距離的接觸可以對其進行活化，同時還參與細胞的信號轉(zhuǎn)導[8-9]。研究顯示，EFNA3的表達差異與腫瘤的發(fā)生發(fā)展等存在密切關(guān)聯(lián)。目前，國內(nèi)已有關(guān)于EFNA3在不同腫瘤中表達情況的研究，且在不同腫瘤中EFNA3的表達情況也有所差異，然眾多研究中并未見EFNA3在結(jié)直腸癌中的研究，因此本課題主要探討EFNA3在結(jié)直腸癌中表達及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集湘南學院附屬醫(yī)院2013～2017年手術(shù)切除的結(jié)直腸病例進行石蠟切片。其中結(jié)直腸癌組織44例，良性結(jié)直腸腫瘤組織20例，正常結(jié)直腸組織20例。對所選結(jié)直腸癌組織進行分組，按照TNM分期標準：Ⅰ～Ⅱ期18例，Ⅲ～Ⅳ期26例；按組織學分級：高分化17例，中低分化27例；按有無淋巴轉(zhuǎn)移：26例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，18例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。結(jié)直腸癌組患者年齡35～99歲（63±14歲），良性結(jié)直腸腫瘤組患者年齡22～80歲（55±20歲），正常結(jié)直腸組患者年齡29～70歲（51±12歲）。

1.2 主要試劑

EFNA3抗體（Bioworld Technology），羊抗鼠/兔二抗試劑及其他免疫組化試劑（廣州深達公司）。

1.3 實驗方法

石蠟切片，烤片2 h，二甲苯脫蠟20 min，過無水乙醇洗去二甲苯，降濃度梯度酒精清洗，抗原修復，過氧化氫中孵育18 min，PBS洗3次（2 min/次），37 ℃一抗孵育（40 min），PBS洗3次（2 min/次），37 ℃二抗孵育（40 min），PBS洗3次（2 min/次），DAB染色（5～7 min），PBS洗3次（2 min/次），蘇木精染色（6～8 min），沖洗，吹干，樹脂封片。

1.4 半定量評分

采用半定量方法記錄免疫組化結(jié)果，高倍鏡下觀察結(jié)直腸癌組中的癌巢細胞或正常結(jié)直腸組和良性結(jié)直腸腫瘤組中的腺上皮細胞，每例標本隨機選取10個鏡頭。對于同一樣本，評分從2個方面進行：（1）將染色強度分為4級，無染色記0，淺染色記1，棕色染色記2，棕褐色染色記3；（2）將陽性細胞百分率分為4級，陽性細胞百分率＜10%記為0，10%～25%記為1，26%～50%記為2，51%～100%記為3。對上述10個鏡頭下的評分結(jié)果取均值，以上評分結(jié)果均保留兩位小數(shù)，將兩個方面的評分累加得到該樣本最終的半定量評分。

1.5 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計學分析利用SPSS 22.0進行，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差表示。EFNA3組間對比采用單因素方差分析，組內(nèi)對比采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 EFNA3表達于正常結(jié)直腸組織，良性結(jié)直腸腫瘤和結(jié)直腸癌中的情況

EFNA3的表達在結(jié)直腸癌，良性結(jié)直腸腫瘤與正常結(jié)直腸組織中均可檢測到，陽性染色定位于胞漿（呈棕黃色）。EFNA3在結(jié)直腸癌組中表達強度低于良性結(jié)直腸腫瘤與正常結(jié)直腸組，差異有統(tǒng)計學意義（3.6±1.3vs5.1±0.6vs4.9±1.3，P＜0.05），正常結(jié)直腸組與良性結(jié)直腸腫瘤組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 結(jié)直腸癌中EFNA3的表達與臨床病理特點的關(guān)系

EFNA3在結(jié)直腸癌組織中的表達強度，高分化組中顯著高于中低分化組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表1、圖1）；按TNM分期Ⅰ～Ⅱ期顯著高于Ⅲ～Ⅳ期，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而在有淋巴轉(zhuǎn)移組中表達強度顯著低于無淋巴轉(zhuǎn)移組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 EFNA3的表達與結(jié)直腸癌臨床病理特點的關(guān)系

圖1 EFNA3在正常結(jié)直腸組織（A）、良性結(jié)直腸腫瘤（B）和結(jié)直腸癌（C）中的表達（×400）

3 討論

EFNA3是一類血管生成抑制因子，存在于胞膜表面。通過與特異性受體結(jié)合來介導細胞的信號轉(zhuǎn)導，進而調(diào)節(jié)細胞的形態(tài)與功能[7-9]。有研究表明EFNA3為miR-210的一個直接作用靶點[10]，低氧條件下miR-210可通過下調(diào)EFNA3促進血管新生[11]。有研究在胰腺導管癌進行實驗[15]，敲除EFNA3，結(jié)果證實EFNA3通過癌細胞的交叉網(wǎng)絡(luò)促進腫瘤細胞的生長，其機制涉及細胞微環(huán)境的改變，特別是腫瘤組織新生血管的形成。有研究采用免疫組織化學的方法在卵巢癌中進行實驗[16]，結(jié)果顯示EFNA3在上皮性卵巢癌組織與正常卵巢組織中表達存在差異。根據(jù)近些年在乳腺癌當中的研究知，EFNA3在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有較為重要的作用，其主要機制是miR-210與靶基因EFNA3的調(diào)節(jié)。乳腺癌細胞分泌的外泌體組成中包含核酸miR-210，miR-210通過外泌體進入血管內(nèi)皮細胞，作用于靶基因EFNA3，活化內(nèi)皮細胞，誘導血管生成因子，從而促進血管的生成[12-14]。因此如果對EFNA3進行深入研究，有望進一步了解結(jié)直腸癌的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移機制，也能為結(jié)直腸癌的治療提供新的靶點。

本研究通過對84例結(jié)直腸組織進行免疫組化實驗，統(tǒng)計結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，EFNA3在結(jié)直腸癌組低表達，且在低分化，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期中表達率降低尤為顯著，即可認為EFNA3表達率越低，腫瘤惡性程度越高。且有研究證實，在多種惡性腫瘤如乳腺癌[15]、骨肉瘤[16]、前列腺癌[17-20]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[6]中EFNA3低表達，實驗結(jié)果與我們的預期相符，EFNA3低表達于結(jié)直腸癌組織中。EFNA3隨著癌癥發(fā)生過程的逐漸深入而表達遞減，因此我們認為EFNA3可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生過程有關(guān)并在其中起到了類似抑癌基因的作用，這一現(xiàn)象可能與結(jié)直腸癌組織對EFNA3基因的抑制有關(guān)，但具體機制尚不清楚?？傊?，對EFNA3在結(jié)直腸癌中進一步研究，有望對結(jié)直腸癌的治療開發(fā)一條新的思路。