天然產物
——作物保護化合物開發中的一種戰略性先導化合物發現途徑

筱 禾 編譯

(上海市農藥研究所，上海 200032)

天然產物(NPs)作為活性成分的來源和大量醫藥和作物保護化合物的開發源泉由來已久。在過去的大約35年中，在某種程度上NPs占美國食品藥品監督管理局(FDA)全部新批準藥物的30%～35%。同樣地，60多年來NPs在作物保護新活性成分開發中具有極為重要的作用。近期銷售數據(2016)表明，NPs對不同類型的作物保護化合物(殺蟲劑、殺菌劑和除草劑)開發的影響不同：對殺蟲劑的影響最大，對殺菌劑的影響次之，對除草劑的影響相當有限(圖1)。但NPs對作物保護化合物的重要性在于其占已知作用機制(MoAs)的60%以上。以殺蟲劑為例，基于NPs/NP衍生或NP合成等效體(NPSE)(圖1)產品的銷售額占全球銷售額的70%以上。因此，NPs影響作物保護化合物開發的潛力依然很大。

盡管NPs的以往作用和未來潛力影響作物保護化合物的開發，但 NP源的發現仍然面臨挑戰。20世紀80年代末至90年代初，醫藥行業中NP的發現有所下降，同期組合庫和高通量篩選興起。當時，NP庫被認為與高通量篩選不太兼容。再加之對耗費大量時間和精力卻收益較少的 NP開發過程日益不滿。醫藥行業偏離 NP發現的另一個影響因素是引入并通過了于1993年12月29日生效的生物多樣性條約，或稱生物多樣性公約(CBD)。但對“生物多樣性公約”的遵守較為復雜，并可能成為各國從其自然資源中獲益的障礙。基于 NP的發現可能存在低收益的風險；很少發現真正具有產品潛力的分子。另外，將一種新的作物保護產品商品化的成本越來越高，使得基于 NP的發現非常具有挑戰性。只有當分子在模型或田間條件下表現出強大的活性時，才會對作物保護化學物質或NPs進行投資，并且在涉及生物資源的前期費用或長期負債較高的情況下，可能會進一步限制對NPs的興趣和評估。最理想的情況是，各國降低生物資源的準入成本，對稀有成果的利益分享做出明確的法律定義。

尋找新NPs的挑戰過去是并且仍然是一個重大問題。正如最近對過去45年中發現的NP進行的分析所觀察到的那樣，每年都會發現更多的NP，但發現真正新穎的NP是成比例減少的。Pye等人的潛在影響研究發現：⑴ 許多NP已被鑒定，但尚未深入探索生物效用或新機遇，以及⑵ 如果要發現新穎NP，則需要不同的NP發現來源和方法。

圖1 天然產物(NPs)、半合成產品、NP仿生產品或具有NP模型但通過其他手段[NP合成等效體(NPSE)]發現的化學領域對2016年終端用戶銷售的影響

與醫藥行業不同，作物保護公司對NPs的興趣并沒有以同樣的方式下降。對NPs作為新作物保護化合物來源的興趣的一個衡量標準是，參與新除草劑、殺菌劑和殺蟲劑開發的作物保護公司每年平均發表的有關NPs的出版物數量。與醫藥行業形成對比的是，作物保護(農化)行業對 NPs的興趣已有一段時間了，特別是從20世紀90年代開始(圖2)，就像醫藥行業的興趣正在下降一樣。但圖2中的數據也可能是對行業興趣和研究工作的低估，因為行業中對出版的重視程度低于學術。20世紀 90年代初在 20個作物保護公司中進行的一項調查的結果也證實了業界對NPs的興趣，其詳細說明了對NPs作為新農用化學品起始點的來源的濃厚興趣。

圖2 參與新農用化學品開發的作物保護公司每年關于天然產物(NPs)的平均文章數

作物保護研究機構利用了許多開發方法，NP源的開發只是其中之一。此外，有關開發一種新的作物保護產品的嚴重挑戰包括將一種分子商品化所需的時間持續增加，平均為10～12年，以及發現和開發一種新的農藥產品的成本最終估計為 2.86億美元。因此，農化公司尋求增加成功概率和加快產品構建的方法至關重要(圖 3)。科迪華農業科技公司(CAS)采用的一種策略是開發利用NPs。如上所述，相當比例的作物保護化合物的已知 MoA的確定與NPs有關或可能有關。因此，NP源開發項目仍有可能發現具有新穎MoA的新作物保護化合物，這是作物保護產品開發的重要途徑之一。盡管作物保護行業對NPs的興趣由來已久，但NP源的開發仍然是為新的作物保護化合物提供靈感和產品的一個具有挑戰性的來源。雖然1993年參與調研的大部分(65%)公司在利用 NPs作為開發手段方面取得了一些成功，但這些公司中的大多數已經放棄了獨自進行NP開發，更多的是采用對外協作。如今，很少有公司獨立開展有關NPs分離和鑒定的項目。偏離NP源開發的原因有如下幾點。首先，如上所述，是尋找真正的新的NPs的根本挑戰和難題。其次，很少有NPs作為作物保護產品直接應用時具有穩定的理化性質，可能需要一定程度的半合成以解決轉化和/或穩定性限制以及提高藥效。最常見的是，NPs最適合作為合成模擬的靈感。但是，將復雜的 NP變成可合成的化學物質可能比其他先導化合物產生方法所耗時間更久。

在CAS(前陶氏益農公司)公司內，NP源的開發是有著悠久歷史的先導化合物產生方法，始于禮來(Elanco)公司的NP研究，后轉入1989年創辦的陶氏化學與 Elanco作物保護合資企業(DowElanco)進行。在20世紀40年代，禮來公司是生產抗生素——青霉素的主要公司之一，隨后在50年代和60年代開發并成功上市了微生物源抗生素——紅霉素(erythromycin)、萬古霉素(vancomycin)、頭孢霉素(cephalosporin)和泰樂霉素(tylosin)。DowElanco/DAS/科迪華農業科技公司對NP源先導化合物產生的興趣持續高漲，部分是由于成功發現并開發了多殺菌素(spinosad)，該化合物是一種土壤微生物產生的NPs，其是自然產生的具高殺蟲活性大環內酯spinosyns A、D混合物。對NP源殺蟲劑的持續關注激勵了第2個基于spinosyns的半合成殺蟲劑乙基多殺菌素(spinetoram)的開發。在此過程中，發現的一類新的spinosyns(21-丁烯基)和利用spinosyn生物合成途徑生成新的spinosyn衍生物也有助于保持研究NPs的興趣。最近，科迪華公司NP源開發項目繼續推出新的作物保護化合物，包括新殺菌劑fenpicoxamid和 florylpicoxamid 以及新的具殺蟲活性合成spinosyn類似物。如上所述，NP源開發項目的重要優勢之一是提高了發現具有新穎MoAs的作物保護化合物的可能性。這一結果在spinosyns和新的殺菌化合物中得到了驗證，并進一步促進了CAS對 NP源先導化合物發現的興趣。下文將討論科迪華公司 NP開發的途徑，包括對菌株保藏的概述，并對科迪華公司經典 NP開發項目進行重點介紹，最后展望未來，用新途徑加快NP開發的選擇。

1 先導化合物發現方法

如上所述，作物保護產品開發中的先導化合物發現方式多種多樣。在CAS，這些被劃分為3個大的方面：競爭者啟發(competitor inspired activities)、生物活性假說(bioactive hypotheses)以及NP發現(圖3)。競爭啟發先導化合物發現方法某種程度上明顯是致力于從專利和科學文獻中拾遺，是一種被廣泛采用和推出商業化產品的成功途徑。話雖如此，此途徑在CAS的實施情況略有不同，因為其目的是確定開發和推出新穎農藥活性基序(motifs)和骨架的起始點，而不是找到知識產權方面的漏洞并獲得衍生類似物的權利。先導化合物發現的第2種途徑是生物活性假說，生物活性先導化合物到生物農藥活性的概念是此途徑的核心。研究人員確定了在任一體系、細胞或整個有機體中表現某種生物反應的特異骨架、基序、官能團以及化合物。這證實了在開發新化合物時引入此類骨架、基序或官能團誘發某種生物反應的可能性更大的觀點。這種證據和核心(如骨架)與生物反應間的相關性越強，就越有可能觀察到新化合物的生物活性。此外，這一途徑取決于早期確保在化合物中構建理想的物理特性，以增加從離體細胞測試到活體植物和昆蟲測試的轉化。第3種先導化合物發現途徑以NPs為中心。NP發現已經且依然是科迪華公司發現先導化合物的三大支柱之一，一定程度上是受NP源產品的影響，如spinosyns(多殺菌素、乙基多殺菌素)帶來超過4億美元的終端銷售額(2014-2016年)。在近 30年，DowElanco/陶氏益農/科迪華農業科技公司NP發現項目的根本是新的、新穎的NPs的鑒定和分離。為了最大限度地提高發現新穎活性分子的機會，已對生物多樣性投入進行了仔細審查。

圖3 利用一系列途徑發現先導物

2 天然產物保藏庫

傳統生物學假設生物多樣性分布不均，在熱帶和海洋環境以及大自然中而非城市和景觀中的可觀測物種數量豐富。為了對 NP發現的多樣性進行取樣，在過去30年，科迪華的NP項目約有90%的投資是與50多個私人、學術和政府實體合作的結果。通過第三方采購，可以從廣泛的地理、環境和分類學來源對生物多樣性進行采樣。在過去25年中，第三方來源的科迪華NP發現包括850 000多個NP提取物和2 500多個NPs純品。其中的絕大多數都是在2013年之前篩選的。從那時起直到現在，科迪華已轉向更有針對性的NP投資途徑。

科迪華NP發現工作的其余部分(約10%)致力于對科迪華菌種保藏庫中的微生物(細菌、放線菌和真菌)進行評價(圖4)。該菌種保藏庫約有44 000個菌株，主要是由科迪華、禮來和Mycogen公司的科研人員歷經30多年從美國土樣中分離所得。從第三方購買了大約10 000個菌種。有三分之一的生物體是因關注新抗蟲性狀的發現而獲得的，其余的是為了發現 NP所得。該保藏庫在很大程度上沒有分類學特征，因為它是在假設來源的多樣性導致生物活性的多樣性的前提下以高通量方式組合的。最近使用16S測序表征該保藏庫的研究揭示了廣泛的分類學多樣性，如圖4所示。該保藏庫的生物體分為3類：14 400個細菌(性狀為主)、10 000個真菌(NP為主)和19 800個放線菌(NP為主)。細菌保藏庫包括6 800個蘇云金芽孢桿菌(Bt)菌株和7 600個非Bt細菌菌株(圖 4)。大部分非 Bt細菌菌株屬于非絲狀放線菌屬，如微球菌(Micrococcus)和短小桿菌(Curtobacteria)。這10 000個真菌菌株中盡管有相當數量的植物病原真菌和昆蟲病原真菌，但主要是未鑒定的土壤真菌。19 800個放線菌菌株大多屬于絲狀放線菌屬，包括約50%的鏈霉菌和50%的稀有放線菌，如小單孢菌(Micromonospora)、糖多孢菌(Saccharopolyspora)、游動放線菌(Actinoplanes)(圖4)。最近，對微生物基因組的研究表明，微生物，特別是放線菌和真菌具有大量在正常實驗室條件下不表達的神秘生物合成途徑。因此，科迪華菌種保藏庫中的菌株對 NP發現的深入研究具有重要的價值。游動放線菌保藏庫將是科迪華公司未來幾年的熱點，將利用代謝基因組學進行進一步研究。

圖4 原陶氏益農(現科迪華)菌種保藏

3 天然產物鑒定策略

用于鑒定發酵液或提取物中令人關注的NPs的策略通常有2種：⑴ 以生物活性為基礎的策略或⑵以結構為基礎的策略(圖5)。以生物活性為基礎的策略包括對粗提物/發酵液進行生物測試評價，如離體殺菌測試。具有活性的粗提物/發酵液隨后被分餾，并進行適當的生物測試再次評價。對確認生物活性的組分進行純化，利用NMR和MS對任一分離化合物進行結構鑒定。以結構為基礎的策略從對粗提物/發酵液中獨特的結構/物理性質屬性的分析評價開始。根據分析評估，與已有的科迪華 NP保藏庫進行對比，以新穎性對粗提混合物進行分餾。對組分的獨特結構特征進行重新評估，隨后進行提純，并進行生物活性測試。盡管時間很長，但科迪華對基于生物活性的策略的關注已被證明在鑒定農化相關NPs方面卓有成效。目前使用的具體工作流程和篩選級聯(screening cascade)如圖6所示。科迪華基于生物活性的NP發現策略發現了50多種化合物被歸類為苗頭化合物(hits)，7種具更特別特性的化合物，包括更高的生物活性，被歸類為活性化合物(actives)。應該注意的是，NP苗頭化合物必須滿足科迪華自己的效用閾值，這與前面討論的其他先導化合物生成方法得到的苗頭化合物和活性化合物類似。從1 665種提取物中提取的這些分子具有足夠用于進一步測試的活性。共有704個提取物被分餾，發現了50多個新穎的苗頭化合物。對從供應商或合作者處獲得的2 500個純NPs進行靶標篩選，得到了100多個苗頭化合物和4個活性化合物。這些分子因獨特的化學或生物活性被先驗選擇，因此具有較高的初始命中率。

圖6 目前科迪華公司用于天然產物(NP)發現的途徑

4 實例研究

科迪華在具殺蟲活性NPs研究中取得了巨大的成績，特別是多殺菌素和乙基多殺菌素，最近還開發了spinosyns的簡化合成模擬物。這些為NP研究工作提供了平臺。因此，從這個角度來看，實例研究將側重于NP研究工作因與spinosyn相關NP工作的遺留和成功而成為可能。

例如科迪華關于mevalocidin的前期工作利用這種方法成功地發現了一個感興趣的新NP (圖7)。在Mycosynthetix的海量真菌提取物篩選中，科迪華從Coniolariella屬的 2個真菌菌株 MSX92917(DA092917)和 MSX56446 (DA056446)的靜態培養中發現了mevalocidin。Mevalocidin對禾本科和闊葉雜草具有廣譜苗后活性。用mevalocidin處理的植物癥狀表明其對禾本科雜草和闊葉雜草具有新穎的作用機制和雙向移動性(ambi-mobility)。雖然NP以高劑量施用表現出良好的苗后活性，但一項對mevalocidin的研究表明，其構效關系范圍甚小，且到目前為止性能并未得到明顯增強。Mevalocidin被認為是通過干擾細胞質中甲羥戊酸/異戊二烯生物合成途徑的早期步驟而致效(圖7)。對擬南芥的一些初步研究表明，活化和代謝(一種原毒素)可能在mevalocidin的總體效果中發揮作用(數據未發表)。此外，生成mevalocidin所需的真菌生物合成機制尚不清楚。為了增強mevalocidin和/或mevalocidin類似物的效果，有必要進行深入研究以了解生物合成、作用機制和在植物體內的歸趨。

最近，介紹了目前正在由科迪華開發的、與日本明治制果株式會社合作發現的一種新穎吡啶酰胺類殺菌劑 fenpicoxamid (圖 8)的一些生物學特性。Fenpicoxamid是最初從放線菌鏈霉菌517-02發酵液中分離得到的天然抗菌化合物UK-2A的衍生物，此發酵液的提取物在離體試驗中對大多數真菌具有很強的抗菌活性(圖6)。吡啶酰胺類化學物質通過與細胞色素 BC1復合物的 Qi位點結合來抑制線粒體呼吸，且與作用于 Qo靶標位點的甲氧基丙烯酸酯類無靶標位點交互抗性。

基于上述原因，UK-2A被認為是值得關注的半合成修飾候選物質，以優化固有的抗菌活性和植物病原體防治所需的其他關鍵特性。由UK-2A發酵后一步合成的fenpicoxamid對歐洲最受關注的冬小麥病原物Zymoseptor tritici(同Mycosphaerella graminicola，小麥葉斑病)具有優異的防效。憑借其新穎的生化作用機制，fenpicoxamid預計將成為歐盟谷類作物抗性治理項目的重要補充。

UK-2A所具有其他可進行半合成修飾的結構特征，為進行構效關系(SAR)研究提供了機會。合成策略側重于研究UK-2A的3個區域：替代“頭部”基團、C7環外酯和C8芐基取代基(圖9)。制備了250多個類似物并評估了它們用于防治小麥葉斑病以及合成的可行性。這些類似物的典型合成路線如圖10所示，雖然一些結構替換使類似物的離體藥效與fenpicoxamid相當，甚至略好，但其功效增益不值得開發。

圖7 萜類生物合成中的甲羥戊酸途徑

圖8 fenpicoxamide和UK-2A的結構式

5 未來NP發現的可能方向

盡管在NPs方面的工作取得了成功，但由于高水平的重復發現，易獲得的骨架缺乏新穎性以及上述由于生物多樣性在獲取大量樣品方面的難度，歷史上依靠采樣來自不同地理來源的大量 NP提取物不再被認為是一條可行的途徑。經過廣泛分析，當前的 NP策略已經轉變為包括其他途徑，例如更有 靶向性來源的NPs。

圖9 合成衍生化策略

圖10 UK-2A的3個區域的衍生化

全基因組測序、宏基因組學和合成生物學方面的最新進展，加之更靈敏的質譜和核磁共振性能，已經迎來了被稱為NP發現的“新黃金時代”或“復興”。研究人員已經成功地證明，基因組導向(genome-guided)的NP發現通過直接從gDNA中捕獲基因簇并隨后在異源寄主中表達得到新穎的 NP骨架。但這種方法的潛力尚未充分實現，因為在鑒定新穎生物合成基因簇(BGC)和隨后預測化學結構方面存在生物信息學的挑戰。一種更可行的方法是基因組分析和代謝組學數據相結合，以更準確地使BGC與已知和未知NP家族的關聯。這種方法的成功與產生的數據集的規模以及多樣化的菌株保藏直接相關，因為在系統發育和NP BGCs間具有明顯的相關性。Metcalf等人的研究表明，相隔0.5%核糖體蛋白距離的2個菌株可能共享幾乎所有的NP基因簇，而相隔7%的則幾乎沒有。這種方法在發現新的NP骨架方面有著廣闊的應用前景，這對于能夠大量獲得這些新穎骨架進行SAR探討并最終用于大規模生產至關重要。在傳統的合成化學方法可能不適用或不經濟的情況下，利用合成生物學可以獲得 NP類似物和合成的有價值中間體。利用合成生物學大規模制備關鍵前體的一個非常成功的例子是青蒿素的前體——青蒿酸的生產。將青蒿(Artemisia annua)的基因簇嵌入重組酵母寄主中，得到了25 g/L發酵效價的青蒿酸。

6 天然產物發現缺口

必須加強行業和科研機構之間的聯系，取長補短，利用NPs帶來的機遇，更好地探討這些不斷發展的技術。許多科研團隊已經分離出了新穎的NPs，但他們沒有完整評估化合物的作物保護生物活性/效用的技術手段。2018年9月25-29日在意大利Bellagio召開的“害物治理中的天然產品：增加其使用的創新方法”會議中，演講者、科研機構以及計劃增加技術手段和降低壁壘測定這些NPs的潛在行業合作伙伴(例如科迪華)就 NPs和相關的植保測試體系間的這種關系達成了共識。科迪華愿與相關科研機構/團隊/公司開展互利共贏合作研究。

7 結 語

NPs具有化學多樣性來源、生物功能和新穎的作用機制。作物保護公司和醫藥公司都在繼續并增加對NP研究的投入。盡管基于NP的發現面臨挑戰，但鑒定新作用機制和新化學起始點的優勢使其成為一個值得追求的目標。展望未來，基因組學的出現及其在 NP發現中的應用可以加速鑒定和開發 NPs或受NPs啟發的農用化學解決方案。