新穎殺菌劑tolprocarb的開發(fā)

葉 萱 編譯

(上海市農(nóng)藥研究所，上海 200032)

作物真菌或細菌病害是導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低的重要因素。殺菌劑被用來防治這些病害，保持作物的產(chǎn)量和產(chǎn)品的品質(zhì)。水稻是亞洲各國種植的最重要作物之一。水稻的生產(chǎn)仍然受到許多病原微生物的威脅，需要新穎的殺菌劑來穩(wěn)定地防治這些病害。

Tolprocarb(圖 1)是日本三井化學(xué)農(nóng)業(yè)公司開發(fā)的防治水稻稻瘟病(Magnaporthe grisea)的殺菌劑。稻瘟病對水稻生產(chǎn)有極大危害，此病害的病原菌已產(chǎn)生抗性，故對其防治是一大挑戰(zhàn)。雖然有許多作用機制的殺菌劑能用于防治此病害，但一些殺菌劑防效已不佳。稻瘟病抗性菌株，例如抗呼吸鏈復(fù)合體III——醌外位點細胞色素bc1(醌外部抑制劑：Qol)抑制劑或黑色素生物合成中脫水酶抑制劑(黑色素生物合成抑制劑——脫水酶抑制劑；MBI-Ds)菌株產(chǎn)生。對tolprocarb的2種作用機制進行了研究：抑制黑色素生物合成途徑中聚酮合酶(MBI-P)和誘導(dǎo)植物系統(tǒng)性抗性。由于 tolprocarb具有獨特的作用機制，推測靶標真菌發(fā)展抗性的風(fēng)險會低。Tolprocarb不僅對稻瘟病，而且對細菌病害有強的生物活性，對哺乳動物或環(huán)境的影響小。本文介紹了tolprocarb的合成、生物活性和作用機制。

圖1 tolprocarb的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 合 成

1.1 先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)

在對卵菌綱病害殺菌劑開發(fā)的過程中，發(fā)現(xiàn)化合物1對水稻稻瘟病有防治作用。化合物1和纈霉威(iprovalicarb)僅在甲基的有無和羰基的位置不同。卵菌綱病原菌殺菌劑纈霉威對稻瘟病沒有活性。有趣的是化合物1對卵菌綱植物病原菌如使馬鈴薯和番茄發(fā)生枯萎病的晚疫病菌(Phytophthora infestans)沒有活性。纈霉威結(jié)構(gòu)的小小改變，其殺菌活性譜發(fā)生很大變化，如圖2所示。如以下所示，化合物1的作用機制不同于纈霉威。

圖2 纈霉威和tolprocarb的化學(xué)結(jié)構(gòu)的對比

在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，稻瘟病菌菌絲由于形成黑色素而變黑，而用化合物1處理后，菌絲的延長沒有被抑制，而顏色變白。化合物1處理的菌絲的顏色不同于用傳統(tǒng)MBI處理的，這表明用化合物1和MBI處理后，積累的中間物不同。此外，研究表明化合物1和MBI-D沒有交互抗性。這些結(jié)果表明化合物1作用于黑色素生物合成途徑中新的靶標位點。因此以化合物1為先導(dǎo)物，對其進行結(jié)構(gòu)修飾。

1.2 先導(dǎo)化合物的優(yōu)化和構(gòu)效關(guān)系

先導(dǎo)化合物1的結(jié)構(gòu)被分成3個部分：A-C(圖1)，對每部分結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化。表1對其構(gòu)效關(guān)系進行了總結(jié)。

基團A中的氨基甲酸酯或硫代氨基甲酸酯鍵比酰胺或脲鍵有更高的活性。在A基團端的異丙基被2,2,2-三氟乙基取代后化合物活性增加。甲基氨基甲酸酯衍生物比異丙基氨基甲酸酯衍生物的活性低。基團B中的S-對映異構(gòu)體(表1)比R-對映異構(gòu)體的活性高。三氟甲基衍生物和異丙基衍生物的活性水平相同。正丙基衍生物的活性低于異丙基衍生物。疏水異丁基和親水的甲基磺酰甲基(methylsulfanyl methyl group)的引入會降低化合物的活性。

表1 化合物1對稻瘟病構(gòu)效關(guān)系的情況

基團C中，引入對甲基比引入鄰甲基或間甲基活性高。在對位引入氯原子比引入甲基的活性低。未取代化合物比2-和3-甲基類似物活性高，但比4-甲基和4-氯類似物的活性低。C環(huán)4-位的取代好像能提高活性。

最后，在考慮各種因素后，例如在田間試驗的長殘留活性，選擇tolprocar來開發(fā)。

2 合 成

以N-叔丁氧基羰基-(N-Boc-)保護的L-纈氨酸甲酯(a)合成tolprocarb，具體如圖3。首先與硼氫化鈉發(fā)生還原反應(yīng)，之后發(fā)生Mitsunobu偶聯(lián)反應(yīng)，再肼解生成胺衍生物(d)。之后形成酰胺鍵，再去N-Boc保護后得到胺衍生物(f)。最后胺衍生物(f)和氯甲酸酯(g)發(fā)生反應(yīng)生成tolprocarb。

圖3 tolprocarb的合成途徑

3 抑制菌絲的生物合成

3.1 作用機制

在 1965年，三共株式會社(現(xiàn)在稱為三井化學(xué)農(nóng)業(yè)公司)開發(fā)了 MBI和 2,3,4,5,6-五氯苯甲醇。在20世紀 70年代研究了黑色素生物合成的還原酶抑制劑(黑色素生物合成還原酶抑制劑；MBI-Rs)，在20世紀90年代研究了MBI-Ds。已知淺藍菌素為黑色素生物合成過程中的聚酮合酶(PKS)抑制劑，但在tolprocarb進入市場、實際應(yīng)用之前，沒有能抑制PKS的其他化合物，tolprocarb是第一個實踐意義上抑制PKS的殺菌劑。

在tolprocarb開發(fā)的早期，就發(fā)現(xiàn)在含有tolprocarb的瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)稻溫病菌菌落時，稻溫病菌的著色受到了抑制。與用含有傳統(tǒng)的MBI，例如MBI-R或 MBI-D的瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落相比，含有tolprocarb的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落著色少。進行了恢復(fù)試驗來評估了tolprocarb的作用機制。用含有黑色素中間體和 tolprocarb的瓊脂培養(yǎng)稻溫病菌來測定絲狀菌落的顏色。在含有tolprocarb瓊脂培養(yǎng)基上的顏色淺的菌落再在含有1,3,6,8-四羥基萘(1,3,6,8-THN)的培養(yǎng)上培養(yǎng)，菌落的顏色恢復(fù)正常。因此，推測tolprocarb通過抑制調(diào)節(jié)聚酮合酶和酮內(nèi)酯(pentaketide )環(huán)化的1,3,6,8-THN上游的聚酮合酶活性而抑制菌落的著色(圖4)。這通過測定含有稻溫病菌的 PKS基因的轉(zhuǎn)基因米曲霉(Aspergillus oryzae)中1,3,6,8-THN積累的量來測定。與一些傳統(tǒng)的MBI相比，只有tolprocarb抑制離體PKS的活性。 這些結(jié)果表明tolprocarb作用于稻溫病菌PKS，這不同于其他傳統(tǒng)的MBI。由于此作用機制，殺菌劑抗性行動委員會(FRAC)把tolprocarb分為MBI-PKS (MBI-P)類別。

圖4 稻溫病菌中DHN黑色素的生物合成途徑和MBI抑制途徑中的酶活性

3.2 對稻溫病菌生命周期的影響

MBI-D和MBI-R等傳統(tǒng)MBI對稻溫病菌生命周期的影響已被確定。這些殺菌劑抑制稻溫病菌附著胞的黑化作用，阻礙分生孢子從分生孢子梗分散。也發(fā)現(xiàn)了tolprocar對這些細胞和孢子的作用。最可能的是，MBI-D/MBI-R和tolprocarb抑制稻溫病菌附著胞的黑化，阻礙分生孢子的分散。暴露于tolprocarb的脫色分生孢子比有色分生孢子對陽光(紫外線光)更敏感。用tolprocar處理后的脫色分生孢子的發(fā)芽率要低于用MBI-D或MBI-R殺菌劑處理的，甚至在多云或雨天(紫外線強度：500～2 000 μW/cm2)。用投射電子顯微鏡法(TEM)發(fā)現(xiàn)附著胞或分生孢子的黑化作用被抑制。稻溫病菌附著胞的黑化對侵染釘產(chǎn)生膨壓，滲透進入寄主細胞重要。相比之下，對分生孢子中黑色素功能研究不多。如前所述，MBI抑制分生孢子從分生孢子梗分散，但具體機制未知。然而，黑化作用與分生孢子從分生孢子梗分散的能力有關(guān)。

4 系統(tǒng)性獲得抗性(SAR)

4.1 擬南芥系統(tǒng)性獲得抗性

SAR是植物體的非特異性系統(tǒng)性免疫響應(yīng)，由信號化合物水楊酸(SA)誘導(dǎo)產(chǎn)生。NPR1和WRKY45調(diào)節(jié) SA信號傳導(dǎo)途徑中的不同病程相關(guān)基因，例如PR-1、PR-2、PR-5和PBZ1，這些基因編碼葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶等 PR蛋白，還調(diào)節(jié)植物抗毒素合成途徑。

測定含有煙草 PR-1a啟動子-Fluc(熒光素酶)報告基因框架(PR-1a::Fluc)的轉(zhuǎn)基因擬南芥的研究表明tloprocarb能誘導(dǎo)擬南芥產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性。在擬南芥的2個生長階段：剛發(fā)芽和3周齡大的植株中發(fā)現(xiàn)了PR-1a啟動子的活性。在處理擬南芥苗后96 h，檢測到擬南芥苗中PR-1a啟動子活性；灌溉處理成熟植株后 96、120 h檢測到植物體內(nèi) PR-1a啟動子的活性。用tolprocarb處理成熟擬南芥葉片，10 d后接種十字花科黑斑病菌(Pseudomonas syringaepv.maculicola，Psm)，評估tolprocarb對此病菌的防治潛力。接種3 d后，Psm侵染量降低。結(jié)果表明tolprocarb處理能誘導(dǎo)SAR活性。

4.2 水稻SAR活性

已確定tolprocarb是擬南芥SAR活性的強誘導(dǎo)劑，因此評估了tolprocarb是否能誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生SAR活性。用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)發(fā)現(xiàn)用tolprocarb處理后水稻中PR基因的活性。在處理后24 h或72 h，tolprocarb促進SA-介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達，例如PBZ、β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶1。相反，其不促進茉莉酮酸-(JA-)-介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)的基因表達。這些表明tolprocarb通過加速SA信號傳導(dǎo)途徑而誘導(dǎo)SAR活性。

已知SA和JA為誘導(dǎo)植物產(chǎn)生免疫力的信號傳導(dǎo)化合物。特別是，SA信號傳導(dǎo)途徑與保護植物免受病原真菌或細菌危害的功能有關(guān)。因此，預(yù)期tolprocarb具有防治水稻細菌病害的潛力，發(fā)現(xiàn)具有防治水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)的活性。

Tolprocarb能阻止水稻葉上病害癥狀的擴展。tolprocarb主要通過MBI-P活性而對稻瘟病有效，但不清楚是否第2種作用機制——SAR活性也在其中起作用，且一直難以發(fā)現(xiàn)是MBI-P還是SAR所致活性。Hiroyuki Hagiwara等人應(yīng)用黑色素中間體的2個恢復(fù)試驗來區(qū)分它們。首先，在用黑色素中間體 1,8-二羥基萘處理的水稻葉上接種稻溫病菌，培養(yǎng)。再在表面交聯(lián)(SCL)的瓊脂培養(yǎng)基上接種稻溫病菌，培養(yǎng)，通過人工培養(yǎng)基上的附著胞來觀察稻溫病菌的侵染。在第1個試驗中，tolprocarb處理阻止了水稻細胞上的黑色素恢復(fù)的稻溫病菌的附著胞滲透入水稻。而后者 tolprocarb處理后沒有抑制 SCL培養(yǎng)基上的病原菌的滲透。這兩個結(jié)果表明活體植物細胞對 tolprocarb處理后阻止黑色素恢復(fù)的稻溫病菌侵染必要。因此，這表明tolprocarb通過2種作用機制抑制稻溫病菌的侵染：MBI活性和誘導(dǎo)寄主的防御響應(yīng)。

5 對稻瘟病的活性

5.1 在田間對稻穗頸瘟的活性

含有9%或4% tolprocarb的顆粒劑是內(nèi)吸性殺菌劑，用于育苗箱中植物的根部，含有3% tolprocarb的顆粒劑施于水稻田水中。Tolprocarb對葉瘟和穗頸瘟有強的防治活性，尤其對穗頸瘟的防效特別高。用約束極大似然法進行的 meta分析和 2007-2015年用9%或4% tolprocarb顆粒劑處理的育苗箱的田間試驗防效數(shù)據(jù)證實了此特性。3%顆粒劑用于水稻田水處理的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析表明在水稻抽穗前5～29 d處理對穗頸瘟有優(yōu)異的防效

Tolprocarb在各種類型土壤中都穩(wěn)定；在36種類型土壤中吸附較小，包括日本的25種火山土，土中的有機碳含量、陽離子的交換能力、磷酸的吸收能力和pH等這些因素都對吸附?jīng)]有影響。試驗土壤的吸附率為7%～42%，而20%～100%吸附的tolprocarb能被水解吸。

5.2 對抗性菌株的活性

水稻病害抗性菌株的出現(xiàn)影響了水稻的生產(chǎn)，是水稻種植中一大問題。在日本，抗MBI-D或QOl菌株的出現(xiàn)成為水稻生產(chǎn)中的難題。tolprocarb對抗MBI-D或Qol菌株有穩(wěn)定的防治作用，將會是實際應(yīng)用中防治水稻真菌病原菌很好的選擇。

6 總 結(jié)

Tolprocarb是從iprovalicarb類似物的衍生發(fā)現(xiàn)的，但其作用機制完全不同于 MBI-P。Tolprocarb也能誘導(dǎo)擬南芥和水稻產(chǎn)生SAR，通過誘導(dǎo)SAR活性而對細菌病害和稻瘟病有很強的活性。由于這兩個作用機制和防效高，抗性不易產(chǎn)生。在水稻田，tolprocarb顆粒劑對稻瘟病有高的防效，對穗頸瘟有卓越的防效，包括對MBI-D或Qol殺菌劑有抗性的菌株。根據(jù)這些特點，tolprocarb對不僅稻瘟病而且細菌病害的水稻病害有穩(wěn)定的強的防效。tolprocarb用于作物生產(chǎn)將會有很好的前景。