光譜技術檢測乳制品品質的研究進展

伍琳琳，蔣萍萍，楊洋，貝君，孫利

（中國檢驗檢疫科學研究院，北京100176）

0 引言

乳制品需要經歷多個加工步驟才能被消費，使其容易受到摻假和污染，加上乳制品本身成分復雜，給檢測帶來很大難度。國家標準中大多采用化學方法，其精度最高。但隨著乳制品消費量急劇增長，面對大通量的檢測要求，化學方法成本高耗時長的缺陷日益突出。為了尋求快速準確的檢測方法，國內外學者做出了很多努力。從19世紀60年代起，實用光譜學逐漸邁向食品領域，并逐步得到人們認可。Kawamura最早用光柵光譜儀等構建了牛奶品質的在線檢測系統，Okazaki使用便攜式拉曼光譜儀檢測牛奶中三聚氰胺；國內韓東海、楊仁杰、陳達、劉歡等[1-4]使用近紅外光譜、二維相關紅外光譜、拉曼光譜及熒光光譜等不同手段進行了相關專項研究。但大多數成果限于一種牛乳成分或單一檢測手段，鮮見多成分多手段的全面論述，故本文作者在參考國內外專業文獻的基礎上，并結合自身實驗感悟總結出檢測乳制品特定成分的最佳手段，是對現有手段的良好補充，實現了“因料施法”的目的。

1 檢測手段

振動光譜可以從簡單的識別到深入的定性和定量分析，它依據的基礎信息是分子等微觀粒子運動的特征，分析過程承載的分析信號是待測樣品的光譜。依據樣品的光譜特征，通過對光譜參數與待測量之間的數學關系即數學模型來實現分析。分子振動可能引起固有偶極矩的變化，也可能引起極化率的變化，這兩種變化可以分別產生紅外光譜和拉曼光譜。其中，紅外吸收位于近紅外和中紅外區。近紅外光譜主要反映含氫基團的倍頻及合頻吸收，中紅外和拉曼均反映分子振動的基頻信息。在歐美等國，分子光譜技術已成為乳制品成分分析的重要手段，并為乳品權威分析機構，如國際乳品聯合會（IDF）及美國分析化學家學會（AOAC）等權威機構所認可。另外電子光譜中的熒光光譜以其高靈敏（靈敏度常可達10-12～10-9）的檢測優勢，在牛乳成分檢測中異軍突起。這4種技術在乳制品檢測中都有各自的亮點與不足。目前較為成熟、應用比較廣泛的牛乳成分分析儀是基于中紅外光譜技術設計研制，利用該原理制造的儀器中，以丹麥FOSS公司的MilkoScan系列儀器為典型代表，這種儀器已在國內的大型乳制品企業使用，效果較為理想。但是該儀器價格比較昂貴，在中小型企業中的普及率不高，另外通常需要樣品前處理，不利于在線檢測。近紅外光譜和中紅外光譜原則上非常相似，但近紅外較中紅外光程短，在常規光纖中具有良好的傳輸特性，故前處理相對簡單且儀器價格相對較低。乳品中的常規成分蛋白、脂肪、總固形物等在近紅外區都有特定的吸收，雖然信號強度比中紅外反映的基頻信息信號弱，但采用合適的化學計量學方法能較好地解決這一問題。加上近紅外光譜在測樣方面的獨特優勢，能在短時間內同時檢測多種乳品成分，使近紅外光譜在乳品成分在線檢測領域比中紅外光譜更具優勢，故本文將不再論述中紅外光譜技術在乳品工業中的應用，將重點論述其他3種光譜技術在乳品檢測方面的獨特潛力及技術優勢。

1.1 近紅外光譜

在鮮牛奶收購過程中，近紅外光譜可以快速測定鮮牛奶中的蛋白、脂肪、乳糖、體細胞和尿素氮等含量，這不僅可以為牛奶后續生產過程中的質量提供保障，也為奶牛群體改良（Dairy Herd Improvement，DHI）又稱“奶牛生產性能測定體系”統領奶業發展提供技術支撐。如Kawanura等[5-7]最早利用光柵光譜儀等構建牛奶品質的在線檢測系統，對非均勻狀態下的牛奶中各成分指標進行預測；李曉云[8]采用便攜式短波近紅外儀大光斑漫反射附件采集牛奶樣品光譜，建立了牛奶中脂肪、干物質的定量分析模型，模型穩定且具有良好預測精度(脂肪r=0.98，RPD=5.02；干物質r=0.98，RPD=3.20)。同樣采用漫反射方式及偏最小二乘建模方法，張中衛等[9]建立了奶粉中蛋白質、脂肪的定量模型（蛋白質R2=0.987，RMSC=0.385；脂肪R2=0.986，RMSC=0.419），模型達到實用化要求。高云天[10]采用近紅外光譜儀和乳成分分析儀對比分析了牛奶中的蛋白和脂肪，結果表明兩者無顯著差異，而近紅外光譜儀方便、快速、高效，更具優勢，可代替乳成分分析儀來檢測牛奶中的蛋白、脂肪。Elainy等[11]的工作也證實了近紅外光譜是一種能定量檢測乳蛋白及乳脂肪的快速、有效手段。這些實驗結果均表明，近紅外光譜在測量乳和乳制品成分方面優于其他分析測定方法。

在乳制品加工過程中，近紅外光譜可以實時監控酸奶發酵過程中的酸度，防止牛奶過度發酵，控制產品的質量。Navrati等[12]利用近紅外光譜(NIR)測定技術和電子鼻技術(EN)對工廠條件下生產的酸乳酪和酸奶的發酵進行監控，對NIR和EN信號進行主成分分析，其第一主成分用來解釋實際發酵進程，之后對光譜信號進行偏最小二乘建立PH和可滴定酸含量預測模型。結果表明，兩種技術聯用可以實時監測和評定酸奶發酵過程中的產品品質；固體脂肪含量（SFC）是奶油、黃油等乳制品生產過程中的常規檢測指標，它對奶油及黃油成品的口感、香味及涂抹性有很大影響。自20世紀60年代以來，核磁共振（NMR）作為一種可靠的手段來測定固體脂肪含量。但直接NMR方法需要三個標準樣品（0%SFC，30%低SFC，70%高SFC）作對照，且樣品預熱時間長，限制了分析速度。于是Meagher等[13]嘗試利用FOSS 6500近紅外光譜儀對奶油生產過程中乳脂固體脂(SFC)含量進行檢測，因為SFC對溫度及其敏感，故配備標準控溫附件采集樣品，使整個實驗過程中樣品溫度保持在60℃，得到模型SEP值在0.385%～0.762%之間，且能在幾秒之內完成測量，指出近紅外有望代替核磁共振成為檢測SFC含量的手段；奶酪制作過程中牛奶凝結的失敗會直接導致產品品質不佳、產量下降，故監測牛奶凝結過程在奶酪制造中十分關鍵。Grassi S等[14]提出了一種基于FT-NIR光譜的過程分析技術方法，采用多元曲線分辨-交替最小二乘（MCR-ALS）用于數據分析，建立的模型很好地描述了凝結過程（解釋方差≥99.93%；擬合度＜0.63%；殘差的標準偏差＜0.0067），并證實了光譜技術對凝結現象的敏感性更高。實驗表明，將FT-NIR光譜與MCR-ALS數據精細化結合可以用于奶酪制造過程中對牛奶凝結的在線監測。

在乳制品摻假鑒定方面，近紅外光譜也發揮一定作用。上世紀90年代，Sumio Kawano等[15]人使用近紅外光譜發現1164 nm，1660 nm，2144 nm，2176 nm處的吸光度值與植物油摻加比例有很強的相關性，并得出黃油中摻加人造奶油的最小檢出摻加量為3%；除了植物油，植物性蛋白也被摻加到乳制品中。Maraboli等[16]應用傅里葉近紅外光譜儀InfraAlyzer 500對乳粉中分別出摻入小麥、大豆、豌豆等植物性蛋白進行了定量預測，對添加植物蛋白濃度0～5%范圍內的所有樣品進行校準，未包含在校準集中的樣本形成單獨的預測集和驗證集。通過對五個波長的吸光度值的一階導數進行多元線性回歸（MLR），獲得最佳結果。校準曲線的回歸系數R2為0.993，SEC為0.20，SEP為0.23，SEV為0.21，證明了近紅外光譜是鑒別奶粉中摻加植物蛋白的非常有效的工具。除此之外，水、乳清、奶粉等常規摻假物也能被近紅外光譜檢出[17-18]。

相比于中紅外來說，牛乳對近紅外譜區吸收較弱，近紅外更容易進入牛乳內部獲取多種成分信息，更適于做乳品成分的旁線檢測及在線監測，控制基本實現實時性。但由于有機物在近紅外譜區各級倍頻和合頻的吸收強度大體上依次比基頻或者上一個倍頻低一個數量級，信息強度降低，譜峰強度減弱，使近紅外測量的檢出限比中紅外的檢出限低一至幾個數量級，它對天然產物的最低檢出限為0.1%。牛乳中三聚氰胺、抗生素等濃度都較低，有些接近近紅外的最低檢測限，增加了準確預測的難度。此時，拉曼技術就能派上用場。

1.2 拉曼光譜

拉曼光譜是一種產生于分子或者晶格振動能級的光子的非彈性散射光譜，拉曼光譜特征峰位置、強度和線寬可提供分子振動、轉動方面的信息，據此可以反映分子中不同的化學鍵和官能團。它以其強大的分子結構指認功能，成為測量牛乳中共軛亞油酸（Conjugated linoleic acid，CLA）含量的最佳方法：共軛亞油酸是人體不可缺少的脂肪酸之一，牛乳是人們獲取CLA的主要途徑。Meurens[19]使用拉曼光譜指認出牛乳CLA分別在1652 cm-1、1438 cm-1、3006 cm-1有特征拉曼信號，并得出此三個特殊信號能準確可靠得檢測出牛乳脂肪中的CLA含量。

相對于紅外光譜，拉曼光譜的測量范圍寬，通常為4 000～40 cm-1，無機化合物的拉曼光譜信息量要比紅外光譜多，且譜峰比較尖銳，故識別無機混合物要比紅外光譜更容易。但拉曼信號通常是非常弱的，每106～108光子中只有一個會發生非彈性散射，此時需要用到表面增強拉曼散射(Surface-Enhanced Raman Scattering，SERS)，它將分子吸附到某些粗糙金屬如金、銀或銅的表面，兩者發生相互作用，可使拉曼信號強度增加104-106倍。天然牛乳中的硫氰酸鈉（NaSCN）是一種無機化合物，它是牛奶中過氧化物酶抗菌體系（LPS）的主要成分之一，能夠抑制和殺滅各種微生物，達到非冷卻條件下牛乳保鮮的目的，但它影響人體碘代謝易造成甲狀腺腫大，對孕婦、兒童及缺碘人士尤其有害。由于冷鏈儲運的發展，2008年衛生部規定在乳制品中不允許添加硫氰酸鈉作為防腐劑。張正勇等[20]將多層瓊脂糖鍍膜的微芯片結合納米銀粒子制成SERS活性基底用于便攜式拉曼光譜儀檢測牛奶中的硫氰酸鈉，一般情況下納米銀溶膠的聚集程度難以控制，拉曼信號的重現性差。利用瓊脂糖鍍膜微芯片使硫氰酸鈉分子均勻分散在其中，提高了基底穩定性。與傳統拉曼光譜相比，其檢測更靈敏，結果更準確，檢出限為5×10-7g/mL，分析過程綠色環保且能同時檢測16個樣品，非常適用于牛奶中硫氰酸鈉現場檢測。

2008年，“三鹿事件”發生之后，三聚氰胺的檢測標準被提上日程，其中高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、液相色譜-質譜/質譜法成為原料乳及乳制品中三聚氰胺檢測的國家標準，但面對高通量、大范圍的檢測需求，其成本高耗時長的缺陷日益突出。拉曼光譜能夠做到三聚氰胺無損快速檢測，是國標方法的極好補充。其中Okazaki[21]最早使用小型便攜式拉曼光譜儀檢測系統牛奶中三聚氰胺，指出676 cm-1是鑒別三聚氰胺的特征拉曼位移，并在不富集的情況下，測得其檢出線為1%；Lou等[22]進一步采用4-巰基吡啶（MPY）修飾的金納米基底對奶粉中三聚氰胺進行檢測研究，將一定量的三聚氰胺摻入至奶粉中，納米金與三聚氰胺迅速結合使MPY結構發生變化。這種變化在SERS光譜上有規律地反映出來，從而達到拉曼信號增強的目的。實驗證明該法可快速檢測到奶粉提取液中0.5 ppb的三聚氰胺。目前，在中國三聚氰胺激光拉曼光譜檢驗儀已應用在各大乳制品企業的奶站和基層工商所、質檢所，其單次檢驗成本僅10元，快速可靠的檢測使三聚氰胺無可逃遁。截至2015年，1054個參測牛場中生鮮乳三聚氰胺檢測合格率已連續7年保持100%[23]；

青霉素是中國畜牧業使用最多的抗生素。由于細菌耐藥性增強，奶農超量添加青霉素并同時加入β-內酰胺酶使其轉化為青霉酸（penicilloic acid，PA）來掩蓋此不法行為。PA作為青霉素的降解產物，仍會殘留在牛奶中從而引起過敏反應。因此，非常有必要檢測乳制品中的痕量PA。當前對牛奶中PA的測量主要依靠酶聯免疫吸附測定（ELISA）和液相色譜-質譜聯用（LC-MS）。但它們需要樣品預處理、費時且成本高。Meihui QI等[24]成功地開發了一種無標記SERS方法來識別和檢測乳制品中的PA。研究表明，具有26 nm金核和9 nm銀殼層的Au@Ag納米顆粒具有寬而強的等離子體共振吸收，其拉曼增強效應主要來自于相鄰納米顆粒的熱點，在這些熱點中，目標分子（PA）本身作為分子連接劑直接誘導Au@Ag納米顆粒的聚集，而不需要外加電場特定聚合劑的輔助作用。同時，采用智能Au@Ag-NPs作為SERS傳感器，在LOD分別為3.00、3.00和4.00 ppm的情況下，實現了對液態奶、酸奶和奶粉中PA的直接檢測，加標樣品的回收率在96.0%～103%之間。與以前的方法相比，SERS技術非常簡單（沒有任何樣品預處理，例如離心、提取和分離過程），每項試驗只需要10μL的樣品，在3 min內完成。因此無標記SERS方法更適合于乳制品中PA的快速現場篩選。

在拉曼光譜測試中，熒光是其最大干擾，是影響定量和定性分析的主要因素之一。由于牛乳中含有熒光物質如維生素、美拉德產物等，當用激光光束照射時，產生的強熒光背景會將拉曼信號湮沒，加上其含量微小，在測定這些物質時，使用熒光光譜分析更為恰當。

1.3 熒光光譜

熒光光譜分為分子熒光光譜和原子熒光光譜。分子熒光指物質分子吸收光子能量而被激發，然后從激發態的最低振動能級返回基態時所發射出的光。在傳統熒光光譜中，為了消除入射光與散射光的影響，一般使激發光與發射光呈90°。但對于牛乳這種吸光度大于0.1的樣品，發射光透出會遇到很大阻礙，若繼續沿用傳統方法需要對牛奶進行酸化、離心、稀釋、過濾等處理，無法滿足在線檢測的要求。1968年Parker嘗試將角度改為56°，即為后來沿用至今的前表 面 熒 光 法（front-face fluorescence spectroscopy，FFFS），該方法增大了樣品光照面，減小了散射作用，省去了不透明物質的前處理步驟，十分適合乳制品快速檢測[25-26]。

本身能夠發射熒光且能形成熒光測量體系的物質相對較少，有機物中以芳香性結構的大分子雜環類物質為主：維生素A是脂溶性維生素，在奶酪成熟過程中，甘油三酯黏度變化、結晶形成等使維生素A周圍環境發生變化，這種變化在熒光光譜中顯示為308 nm、322 nm處的譜峰向長波方向移動。R.Karoui[27]利用這種變化，結合主成分分析（(Principal Component Analysis，PCA）和因子判別分析(factorial discriminant analysis，FDA)監控半硬質奶酪的成熟過程，取得了良好效果；Becker[28]利用標準AOAC熒光分析法檢測原味酸奶中的核黃素。散射光干擾是提高其靈敏度的主要限制因素，為得到準確結果，進行多次空白測定，對散射光的影響進行校正，進而得出熒光光譜與核黃素含量之間的相關系數為0.99，建立偏最小二乘回歸模型得到的相關系數為0.97。又因為核黃素在奶制品光氧化中發揮關鍵作用，可作為奶制品早期氧化的標志物，進而能夠監控牛乳腐敗；當人們加熱生奶，企圖殺滅其中的致病菌、繼而希望徹底殺滅所有細菌時，殊不知高溫會導致牛奶中乳蛋白和乳糖發生美拉德反應（Maillard reaction）而產生對人體有害的物質。早在上世紀末，研究者們就發現熒光光譜能夠檢測牛乳加熱時的品質變化：1996年Morales[29]在試管中加熱牛奶并用熒光光譜測出牛奶的動能值；1997年Dufour[30]利用FFFS區分均質、加熱后的牛奶；1998年Birlouez[31]又引進“高級美拉德產物與可溶性色氨酸的熒光特性”（Fluorescence of Advanced Maillardproducts and Soluble Tryptophan，FAST）監控牛奶加熱進程。因FFFS對牛乳加熱過程的敏感性及不需任何前處理的優勢，成為在線監控牛乳加熱品質的最佳手段，并已作為過程分析技術（process analytical technology，PAT）應用于實際生產當中[32]。

原子熒光是指基態原子(一般為蒸汽狀態)吸收合適的特定頻率的輻射而被激發至高能態，而后以光輻射的形式發射出特征波長的熒光。據此原理，氫化物發生技術(HG)與原子熒光光譜(AFS)相結合形成HG-AFS分析技術：砷、鍺、硒、汞等元素的氫化物具有揮發性，借助載氣流導入原子化器或激光光源中，從而進行原子光譜的定量測量。由于這些元素的主要熒光譜線恰是日盲光電倍增管靈敏度的最好階段，且能與基體分離，大大降低了基體干擾，使HG-AFS在該方面有其他技術難以達到的靈敏性與準確性[33]，加上其儀器結構簡單無需分光設備，價格低廉，對利潤較低的食品業有很大優勢。GB 5009.93-2010食品中硒的測定、GB/T 5009.11-2003食品中砷的測定和GB 5009.12-2010食品中鉛的測定均使用該法；吳平[34]探索原子熒光光譜法對牛奶中鉛含量的測定，前處理采用免消解的酸蛋白沉淀法，并在體系中加入硼酸形成緩沖試劑，從而滿足了HG-AFS測鉛時對環境酸度的苛刻要求，提供了快速可靠無污染的檢測方法，完成能夠適應企業需要；Patricia[35]還建立了懸浮體進樣法同時檢測乳中砷、硒、銻、碲、鉍的氫化物發生原子熒光法，As、Sb、Se、Te、Bi的檢出限分別為2.5 ng/L，1.6 ng/L，3 ng/L，6 ng/L，7 ng/L，使HG-AFS技術在該領域大放異彩。

2 光譜檢測所面臨的挑戰

（1）近紅外光譜技術的重大挑戰是建立穩健的模型。建立的模型必須經過認真的系統設計和驗證，否則所建立的模型極易受樣品基體的影響，如牛乳樣品的乳脂肪球粒度、密度等都對其結果產生影響，而系統的設計和驗證工作通常需要大量的時間、精力和資金；儀器設計缺少一致性是近紅外光譜技術另一個重要問題。由于儀器零件不精密，儀器之間存在臺間差，將極大限制近紅外技術的推廣和應用；

（2）表面增強拉曼光譜雖然能檢出牛乳中微量痕量物質，但用于定量分析還有很長的路要走，因為目前沒有其他技術保證SERS定量分析的可靠性。SERS的定量分析首要解決的是增強基底的均一性和可靠性。納米材料不同位點的增強效應不同，粒子靠近，耦合和增強效應就強，反之就弱；另外一個關鍵問題是檢測方法的選擇性。像牛奶這樣的復雜體系，SERS將獲得大量待測分子和干擾分子的信息，如果沒有優異的選擇性，則無法篩選出待測分子的信號；另外，增強劑的保質也很重要，放置一段時間后，一旦增強劑變質，再高再均一的增強襯底都沒有意義；

（3）原子熒光光譜儀是國產自主知識產權科學儀器中的佼佼者，但其一直以來的用戶幾乎都是大陸上的中國企業，無法走向國際市場。原因是原子熒光檢測具有一定的局限性，如備受關注的鉛，雖然能夠測定，但對反應體系酸度、載氣流量、屏蔽氣流量等要求非常苛刻；另外，原子熒光光譜理論體系遠不如原子吸收光譜成熟。現階段，美國和歐盟只承認原子熒光測汞的方法，其他元素在理論體系的構建及推廣方面還有待提高。

3 結果與展望

近紅外光譜技術能夠實現乳制品在線檢測，在牛乳成分檢測及常規摻假中發揮重要作用，制約其大規模推廣應用的主要瓶頸在于模型數據庫的建立與維護，需要組建行業的建模中心，圍繞儀器選型、實驗方法優化與規范化、建模算法與攻略、網絡化運行等方面做扎實的基礎研究和系統的技術開發等工作。隨著我國乳品行業的發展，近紅外光譜分析技術必將逐步取代目前在國內占主流的傳統化學分析方法，在乳制品行業發揮越來越大的作用。另外，隨著有關近紅外相關標準[36]的逐步引入，未來近紅外技術在乳品行業也必將像飼料、糧油和紡織等其他行業有章可依、有據可鑒；拉曼技術偏向于分子結構解析及微量痕量有害物質檢測，小型化是拉曼儀器未來發展方向之一，實現精準的定量檢測是站在該技術制高點的關鍵；熒光光譜在檢測熒光物質時有著極高的靈敏度且不可替代的檢測優勢，開發可以在現場進行分析和在線檢測的便攜式HG-AFS分析儀器是當前的重要研究課題，也是未來原子熒光發展的重點。

這三種光譜在乳制品品質檢測中具有極大優勢和發展空間，幾種光譜聯用，再結合現有的理化方法，能夠基本滿足目前國內對大通量乳制品的檢測需求，從而保證產品品質。