PINK1/Parkin介導線粒體自噬對缺血性腦卒中作用的研究進展

靳曉飛 高維娟

(河北中醫學院 河北省心腦血管病中醫藥防治研究重點實驗室，河北 石家莊 050091)

腦卒中具有發病突然、起病急驟、致殘率高和死亡率高等特點，尤其是60歲以上的老年人則具有更高的發病率和死亡率〔1〕。腦卒中主要包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩大類，其中缺血性腦卒中的發病率和致死致殘率不斷攀升，占全部腦卒中的60%～80%〔2,3〕。缺血性腦卒中的發生機制十分復雜，涉及興奮性氨基酸毒性、鈣離子超載、炎癥反應、細胞凋亡、線粒體功能障礙等，且這些因素相互影響相互聯系，形成惡性循環，最終造成不可逆性腦損傷〔4,5〕。研究發現，線粒體功能障礙是缺血性腦卒中發生發展過程中的重要環節，因線粒體功能障礙所引起的線粒體自噬與缺血性腦卒中密不可分。

1 線粒體自噬與缺血性腦卒中

1.1細胞自噬的概念 自噬是指在自噬相關蛋白的調節下，由脫落的內質網膜或高爾基體膜與細胞內損傷的細胞器或異常的蛋白質相結合，形成雙層膜結構的自噬小體，進而與溶酶體逐漸融合，形成自噬溶酶體，隨后通過溶酶體酶降解其所包裹的內容物，從而實現組織細胞的代謝需要或某些細胞器的更新〔6〕。隨著對自噬的深入研究發現，自噬包括多種形式，目前已發現至少有5種選擇性自噬類型：線粒體自噬、內質網自噬、核糖體自噬、過氧化物酶自噬和異源自噬等。各個類型的自噬參與了機體的不同生理過程，在維持組織和細胞內環境穩定中發揮著非常重要的作用。

1.2線粒體自噬的概念和過程 線粒體自噬是指細胞通過自噬調控機制選擇性清除損傷或功能障礙線粒體的過程，對于調節線粒體功能和維護細胞生存具有重要作用〔7,8〕。有研究指出，線粒體自噬的過程可分為兩個階段，即線粒體自噬“兩步模型”〔9〕。第一階段：受損或功能障礙的線粒體和自噬相關基因ATG上游調控蛋白集聚于自噬小體結合位點。線粒體受損后，其外膜調節蛋白將激活PINK1/Parkin調控的泛素化反應，泛素化的線粒體和自噬相關基因ATG上游調控蛋白與自噬小體結合位點發生耦聯。該過程不需要隔離膜參與，同時也不依賴于微管相關蛋白1輕鏈(LC3)-Ⅱ；第二階段：形成自噬小體。受損的線粒體被隔離膜逐漸包裹，形成具有雙層膜結構的自噬小體，自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，被包裹的線粒體在溶酶體酶的作用下被降解利用。該過程不僅需要LC3-Ⅱ及連接LC3與線粒體的接頭蛋白p62、optineurin、NBR1的參與，同時FUNDC1、Nix/BNIP3、SMURF1等在這一階段也發揮了關鍵作用。線粒體自噬作為自噬的重要形式之一，在調控細胞內穩態、增殖、分化、遺傳、衰老和死亡等細胞進程中發揮重要作用，是控制線粒體質量的重要機制。研究發現，線粒體自噬與阿爾茨海默病、帕金森病和亨延頓病等神經退行性疾病，心腦血管病、內分泌疾病、固有免疫疾病、惡性腫瘤等密切相關，且其在缺血性腦卒中的發生發展過程中更是扮演著不可替代的角色〔10〕。

1.3線粒體自噬在缺血性腦卒中的神經保護作用 線粒體作為“細胞的動力室”，不僅可以產生(ATP)為機體提供能量，而且在控制活性氧(ROS)產生、維持鈣穩態、調節滲透壓、轉導細胞信號等方面均起著重要作用。缺血性腦卒中最直接的損傷是腦內能量供給急劇減少，同時引起線粒體的形態、結構和功能破壞，從而進一步加劇細胞能量代謝障礙。受損的線粒體在缺血再灌注期間還可產生大量ROS，加重氧化損傷，引起鈣穩態失調，最終導致細胞死亡。缺血性腦卒中發生后，在引起線粒體損傷的同時也激活了線粒體自噬，線粒體自噬可通過及時識別和清除損傷的線粒體和異常的蛋白質，調節線粒體功能，控制線粒體質量，發揮神經保護作用〔11〕。

Zuo等〔12〕采用大鼠局灶性大腦中動脈閉塞法建立缺血性腦卒中模型，并通過腹腔注射葡萄糖模擬缺血性腦卒中發病后的高血糖狀態，觀察了線粒體自噬和高血糖對腦缺血大鼠的影響，發現輕度高血糖大鼠腦缺血損傷程度并不加重，而重度高血糖可通過抑制線粒體自噬，使清除受損線粒體的功能發生障礙，引起細胞能量代謝障礙和線粒體途徑細胞凋亡損傷，神經功能缺損和腦梗死容積均明顯加重，表明線粒體自噬可發揮神經保護作用。Zhang等〔13〕采用氧糖剝奪/復氧復糖法建立神經元體外缺血/再灌注損傷模型，應用特異性熒光染色對自噬小體和線粒體進行標記，發現模型組中自噬小體和線粒體的熒光標記大量重疊，而正常對照組中熒光標記重疊很少，表明線粒體自噬在氧糖剝奪/復氧復糖神經元中被明顯激活。為進一步研究線粒體自噬在缺血性腦卒中的作用，Zhang等〔13〕采用小鼠短暫性大腦中動脈閉塞法建立在體缺血性腦卒中模型，并于缺血再灌注的同時給予自噬抑制劑3-MA側腦室注射處理，發現與模型組相比，3-MA給藥組小鼠腦梗死容積明顯增加，同時自噬相關蛋白Beclin1和ATG7表達降低，自噬小體和線粒體熒光重疊明顯減少，表明線粒體自噬在缺血再灌注期間發揮保護作用。Li等〔14〕通過建立大鼠短暫性缺血性腦卒中模型，于缺血再灌注的同時給予自噬激活劑雷帕霉素處理。結果發現，雷帕霉素給藥組線粒體自噬明顯增強，腦梗死容積和線粒體功能障礙均顯著減輕，進一步證實了線粒體自噬對缺血性腦卒中可發揮神經保護作用。

2 PINK1/Parkin與線粒體自噬

目前研究，哺乳動物體內調控線粒體自噬的機制主要有兩種方式：Parkin依賴性途徑和Parkin非依賴性途徑。其中，Parkin依賴性途徑是指由線粒體外膜蛋白酶PINK1與E3泛素連接酶Parkin介導的線粒體自噬；而Parkin非依賴性途徑主要是指由NIX/BNIP3信號通路介導的線粒體自噬和FUNDC1信號通路介導的線粒體自噬〔15，16〕。Parkin依賴性途徑，即PINK1/Parkin介導的線粒體自噬，作為調控線粒體自噬的經典通路，目前研究最為廣泛也是研究最清楚的線粒體自噬信號通路，其在調控線粒體自噬和維持線粒體功能方面發揮著重要作用。

2.1PINK1的結構與作用 PINK1是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由581個氨基酸組成，在哺乳動物各組織器官中廣泛表達，尤其在神經系統、心臟和骨骼肌中含量豐富。PINK1氨基酸序列根據其功能不同可分為四個區域：N端線粒體靶定信號肽、線粒體內膜轉移終止信號肽、絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域、C端線粒體外膜滯留信號肽〔17〕。正常情況下，PINK1在線粒體外膜轉運酶的作用下，由線粒體外膜不斷被轉移到線粒體內膜，被線粒體內膜上的早老素菱形蛋白(PARL)不斷切割分解，因此正常線粒體中的PINK1表達較低，不容易被檢測到〔18〕。但是，當線粒體受損，膜電位出現去極化時，PINK1不能被順利轉移到線粒體內膜，無法被相關蛋白酶降解利用，而是集聚在線粒體外膜，并將招募Parkin到受損線粒體。

2.2Parkin的結構與作用 Parkin是一種E3泛素連接酶，擁有465個氨基酸，根據其氨基酸序列功能不同可分為五個區域：N端泛素樣結構域、RING0結構域、RING1結構域、RING1與RING2之間的IBR結構域、RING2結構域。其中，N端泛素樣結構域的功能主要包括識別細胞基質、結合SH3、聯合蛋白酶體、調節泛素蛋白和Parkin活性等〔19〕。正常情況下，Parkin主要通過兩種調控機制維持自身穩定狀態：①在RING2結構域和IBR結構域之間存在抑制序列，即Parkin抑制因子，該抑制因子可阻斷E2結合位點與RING1結構域之間的聯系；②RING0結構域將位于RING2結構域上的泛素蛋白酶結合位點半胱氨酸遮蓋起來，半胱氨酸無法發揮催化作用，從而維持Parkin自身穩定抑制狀態。當線粒體受損時，Parkin的空間結構發生變化，半胱氨酸暴露，催化作用啟動，Parkin獲取磷酸化催化活性，活化的Parkin可催化位于線粒體外膜和胞質中的蛋白質引起泛素化修飾，泛素化的線粒體在多種自噬相關蛋白的調節下，被具有雙層膜結構的自噬囊泡包裹，形成線粒體自噬小體，隨后線粒體自噬小體與溶酶體逐漸融合，形成線粒體自噬溶酶體，被包裹的受損線粒體在溶酶體酶的作用下被降解和利用，從而維持細胞內環境的穩定〔20～22〕。

2.3PINK1/Parkin介導線粒體自噬對缺血性腦卒中的作用 大量研究證實，PINK1和Parkin在同一條基因通路上發揮作用，PINK1位于Parkin上游，二者相互作用可誘導線粒體自噬的發生〔23～25〕。缺血性腦卒中引起線粒體損傷時，PINK1作為受損線粒體的分子探測器，可及時感應受損線粒體膜電位的下降，穩定集聚在線粒體外膜，招募Parkin轉位到受損線粒體，誘導線粒體自噬發生，使受損線粒體被線粒體-自噬-溶酶體途徑降解和利用〔24,26〕。另外，PINK1和Parkin之間相互作用并保持著相對平衡，該相對平衡作用在重建線粒體膜電位、提高信號傳導效率、防止線粒體自噬過度引起自噬性損傷，建立嚴格的線粒體質量調控機制等方面具有重要意義〔27，28〕。

Safarpour〔29〕應用缺血性神經元，初步觀察了PINK1和Parkin在缺血性神經元中的作用。研究發現，敲除PINK1或Parkin基因均可引起神經元興奮性氨基酸毒性反應，PINK1和Parkin任一基因缺失均可加重神經元損傷，提示PINK1/Parkin對缺血性腦卒中可能發揮著重要作用。Wu等〔30〕應用大鼠海馬神經元通過氧糖剝奪/復氧復糖法建立缺血性腦卒中細胞模型，在離體細胞水平，觀察了H2、自噬激活劑雷帕霉素、自噬抑制劑3-MA對氧糖剝奪/復氧復糖大鼠海馬神經元的影響，探討了PINK1/Parkin信號通路介導線粒體自噬在缺血性腦卒中的保護作用。結果發現，H2和雷帕霉素均可提高細胞活性，抑制ROS水平和細胞凋亡率，而經3-MA處理后的神經元，其細胞活性明顯降低，ROS水平和細胞凋亡率明顯上升；隨后，進一步觀察了線粒體膜電位(MMP)和線粒體自噬情況，發現H2和雷帕霉素對MMP的丟失有保護作用，同時可增加線粒體與GFP-LC3的共定位，提示線粒體自噬的發生，而3-MA則具有相反的作用；最后，檢測了線粒體自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、PINK1和Parkin的表達，發現H2和雷帕霉素可顯著誘導氧糖剝奪/復氧復糖大鼠海馬神經元LC3-Ⅱ、PINK1和Parkin的表達，而3-MA可抑制LC3-Ⅱ、PINK1和Parkin的表達，表明PINK1/Parkin介導的線粒體自噬在氧糖剝奪/復氧復糖大鼠海馬神經元中可發揮神經保護作用。Rui等〔31〕采用大腦中動脈閉塞法建立缺血性腦卒中大鼠模型，在動物水平，觀察了缺血性腦卒中大鼠腦梗死體積及LC3、Beclin1、LAMP-1、PINK1和Parkin的表達水平，探討了PINK1/Parkin信號通路介導線粒體自噬對缺血性腦卒中大鼠的作用。研究發現，大鼠腦缺血再灌注不同時間點均可導致大腦中動脈區域梗死，并伴有全腦損傷；LC3B、Beclin1和LAMP-1再灌注后表達不斷上調，并在再灌注24 h達到高峰；此外，再灌注24 h時線粒體外膜PINK1表達明顯增加，Parkin線粒體易位增加；而當給予PINK1抑制劑處理后，大鼠腦梗死體積明顯增加，Parkin線粒體易位減少，LC3B、Beclin1和LAMP-1表達降低。該研究結果進一步證實了PINK1/Parkin信號通路通過介導線粒體自噬參與了缺血性腦卒中的病理生理過程，并且在其中發揮保護作用。

因此，PINK1/Parkin信號通路介導的線粒體自噬在缺血性腦卒中的發生發展過程中發揮著不可替代的作用。如果能夠準確調控PINK1/Parkin介導的線粒體自噬，很可能會找到防治缺血性腦卒中新的治療靶點和作用機制。

3 小結與展望

缺血性腦卒中是危害人類健康的常見病，特別是60歲以上的老年人具有更高的發病率和死亡率，如何有效降低缺血性腦卒中的發病率和死亡率已經成為臨床上亟待解決的客觀難題。缺血性腦卒中發生后，可嚴重破壞線粒體的形態、結構和功能，引起細胞能量代謝障礙，甚至引發惡性級聯反應。線粒體自噬在缺血性腦卒中發生后可以應激性被激活，及時清理受損線粒體和功能異常的蛋白質，維持細胞內環境穩態，發揮神經保護作用。PINK1/Parkin是介導線粒體自噬的關鍵通路，在調節線粒體自噬和維持線粒體質量等發面發揮著重要作用。PINK1作為受損線粒體的分子探測器，能夠準確識別線粒體受損，引導Parkin轉位到受損的線粒體，激活PINK1/Parkin和自噬相關信號通路，誘導線粒體自噬的發生，使受損的線粒體被線粒體-自噬-溶酶體途徑降解和利用，最終達到拮抗缺血性腦卒中的目的。然而，隨著對線粒體自噬和缺血性腦卒中的不斷深入研究發現，線粒體自噬是一把“雙刃劍”，其在缺血性腦卒中的作用可能與腦缺血時間、缺血程度及再灌注不同病理過程密切相關，過度線粒體自噬可引起自噬性細胞損傷，加重缺血性腦卒中〔32,33〕。因此，如何更加精準地調控PINK1/Parkin介導的線粒體自噬，甚至應用某些藥物進行干預，充分發揮PINK1/Parkin介導的線粒體自噬在缺血性腦卒中的神經保護作用，將是我們進一步努力研究的方向。