乳酸菌生物膜的形成及其影響因素

王星，張華，2，張淼，王小杰，談重芳

（1.鄭州大學物理學院（微電子學院）河南省離子束生物工程重點實驗室，鄭州450052；2.河南牧業經濟學院食品生物工程學院，鄭州450046）

0 引 言

乳酸菌是指能夠通過發酵碳水化合物即糖類產生乳酸的無芽孢、不運動或少運動、革蘭氏呈陽性、過氧化氫呈陰性的一類細菌的總稱[1]，具有耐酸耐膽鹽、抑制致病微生物、抗氧化活性[2]、調節腸道微生物群[3]，提高人體免疫力[4]等多種功效，并且能夠幫助預防、治療或輔助治療多種疾病的發生。

生物膜是一種有組織的、具有功能性的細菌群體，是由菌體外的大量胞外基質與細菌團塊組成的微生物集合體[5]。自然界中的微生物在一定適當情況下幾乎都能形成生物膜，當細菌形成生物膜時，對抗生素或宿主本身免疫防御系統的抵抗作用將會增強[6]，所以目前對生物膜的研究大多集中在細菌生物膜的耐藥性及生物膜的清除方法[7]上面。

對于乳酸菌是益生菌這一說法，人們早已了解并對其進行了廣泛利用，但目前人們對乳酸菌等益生菌生物膜作用機制的研究還很有限。生物膜具有黏附性，耐藥性，移動性等特點[8]，如果病原菌形成生物膜，便會給臨床治療帶來很大困難[9]，但如果益生菌形成生物膜，則能更好的黏附到人體，更好地發揮益生作用。生物膜形成可以使乳酸菌菌體結構更加穩定，顯著提高自身抗逆性[10]，可以幫助乳酸菌抵御外界的不利因素等[11]。但生物膜的形成和發展受多種因素的影響，本文主要對乳酸菌生物膜的形成以及影響乳酸菌生物膜形成的因素進行了闡述。

1 乳酸菌生物膜的形成及其影響

1.1 組成

生物膜的結構及成分極其復雜，其形成和發展受到多重因素影響，成熟的生物膜主要包括細菌分泌的胞外聚合物和細菌生命體等[12]。胞外聚合物主要是指細菌分泌的各種生物大分子物質如多糖，蛋白質等，這些物質能夠加強微生物細胞對外界的抵抗能力，同時還對細胞膜的穩定性[13]有一定影響。

1.2 形成機制

乳酸菌生物膜的形成與細菌生物膜的形成一樣，都是動態發展的過程，主要包括以下5個階段[11]。

（1）生物膜的可逆黏附：細菌成熟生物膜形成的首要要求就是要先與物體進行接觸，首先菌體黏附到物體的表面，物體表面準備形成生物膜，在這一階段，細胞的黏附強烈依賴于細菌細胞表面的物理化學性質。

（2）生物膜的不可逆轉黏附期：當進行黏附的細菌不斷增多，使一些特定基因得到表達，由此生物膜開始形成，與此同時，大量的多聚物被分泌到胞外，細菌的黏附由細菌與表面的弱相互作用轉變為與胞外多糖的永久性結合[14]。

（3）生物膜結構的早期發展：在細菌與物體的黏附變為不可逆后，細胞大量聚集形成微生物菌群，這是微生物積累和生物長的共同結果，是產生胞外多糖的主要階段[15]。這些胞外多糖可以使微菌落的結構變得更加穩固，從而使得生物膜變厚。

（4）生物膜的成熟：進入成熟期的生物膜會形成有組織的結構，此結構的形成是由于類似蘑菇狀或株狀的細菌團塊不斷累加堆積導致的,從而使得生物膜變得更加厚,并開始圍繞著菌落旁的輸水管道進行著養料、酶、代謝產物的運送傳輸以及廢物的排出。

（5）生物膜的分散：分散是指將生物膜或載體表面的細菌解離釋放出來。生物膜結構成熟后，生物膜細胞將從物體表面脫離，并且立刻恢復為浮游生物，開始尋找新的結合位點，在物體的表面進行新一輪生物膜的形成。

1.3 乳酸菌生物膜的影響

1.3.1 乳酸菌生物膜對其耐受性的影響

乳酸菌生物膜在形成過程中，涉及到多種基因的表達及電荷轉移等物理化學變化，經歷各種外界環境壓力，導致其相關應激基因表達量提高，且對環境適應及耐受能力也得到提高[10]。張國麗等人[16]的研究表明，植物乳桿菌SCP53 生物膜成熟后對溫度、酸堿度、鹽度的耐受力都得到顯著提升。王坤等人[17]的研究表明了類似的結果，乳酸菌混菌生物膜與游離菌株相比對酸和高溫具有更高的抗性，且能夠穩定釋放游離菌株。Hiromi Kubota 等人[18]對成膜后的植物乳桿菌的研究表明，與浮游細胞相比，成膜后的菌株對機酸、乙醇或次氯酸鈉具有更高的抗逆性。這些結果表明，生物膜的形成使乳酸菌具有更高的耐受性。

1.3.2 乳酸菌生物膜對其抑菌能力的影響

乳酸菌附著于腸道表面形成一定的生物膜，與其他物質競爭營養物質和空間，從而抑制有害菌的黏附并分泌過氧化氫，有機酸等物質來抑制病原菌的生長[19]。Barbarb 等[20]研究者發現，在乳酪生產中四種乳酸菌（植物乳桿菌DSM1055，干酪乳桿菌DSM20011，彎曲乳桿菌DSM20019，副干酪乳桿菌DSM20207）混菌生物膜可以有效地抑制李斯特菌的生長。Elena等[21]的研究表明乳酸菌黏附于口腔黏膜及成為牙齒生物膜一員競爭牙齒病原菌，來抑制病原菌的生長。

1.3.3 乳酸菌生物膜對發酵工業的影響

乳酸菌形成生物膜后具有穩定的結構，在工業化發酵工程中具有良好的潛能。Rangaswamy 等[22]人利用德氏乳桿菌形成的生物膜填充到反應器中來生產乳酸，極大地提高了乳酸的生產效率。Furukawa 等[23]的研究表明，釀酒酵母與植物乳桿菌混合生物膜的形成促進米醋發酵。除此之外，釀酒酵母與植物乳桿菌混合生物膜可作為一個穩定高效生產酒精的手段，不需要人工操作即可通過不到20%的葡萄糖便能產生足夠的乙醇[24]。

2 影響乳酸菌生物膜形成的因素

2.1 葡萄糖對乳酸菌生物膜形成能力的影響

葡萄糖作為乳酸菌生長的重要能量來源以及生物膜的組成部分，為其提供生長所必須的營養，因此影響著乳酸菌的生長及其生物膜的形成。張立東等[25]研究了四株乳酸菌生物膜形成的影響因素，表明在無葡萄糖的MRS 培養基上乳酸菌的生長受到顯著抑制，且幾乎無法形成生物膜。因此，組成生物膜的胞外多糖是由菌體自身分泌的，葡萄糖的有無影響著乳酸菌的生長，從而影響乳酸菌生物膜的形成能力。任曉鏷等[26]對戊糖乳桿菌生物膜的研究也得出類似的結果，雖然乳酸菌的生長能力隨著葡萄糖濃度的增加會加強，但其成膜能力則先增強后下降，由此說明了適于乳酸菌形成生物膜的葡萄糖濃度有一定范圍，濃度過高或過低都會產生不利的影響。

2.2 金屬離子對乳酸菌生物膜形成能力的影響

金屬離子如Cu2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Na+等與生物膜的形成關系密切。在任曉鏷等[26]對戊糖乳桿菌生物膜的研究中顯示出一定濃度的Ca2+對可以影響其生物膜的形成，當Ca2+質量分數為1.5%時，對戊糖乳桿菌生長情況的影響并不大，但其生物膜的形成能力在Ca2+質量分數到達0.5%時就基本被完全抑制。王堯禹等[27]的研究顯示出類似的結果，其研究表明氫氧化鈣能夠通過抑制糞腸球菌毒力因子等的表達來抑制其生物膜的形成。Lukas Gritsch 等[28]研究表明Cu2+和Cu+對生物膜的形成能力都有一定的抑制作用，其中Cu+對生物膜具有更強的抑制作用。張國麗等[29]研究表明，Cu2+通過抑制生物膜分泌胞外多糖達到破壞生物膜穩定性，抑制生物膜形成的目的。

Mn2+對乳酸菌生物膜的形成具有促進作用，在Yanjun Yong 等人[30]的研究中，Mn2+的存在能夠促進植物乳桿菌CCFM436 分泌胞外蛋白，增加乳酸菌生物膜的穩定性。Soma Nozaka 等[31]人對植物乳桿菌及混合菌生物膜形成能力的研究中，同樣表明了錳離子的添加能夠促進植物乳桿菌單菌及混合菌形成致密的生物膜。Mg2+是多種酶的輔基，林雅茵等[32]認為Mg2+能夠使細菌的早期黏附能力得到加強，還能影響生物膜初期和成熟期的結構，因此Mg2+的添加會使得生物膜變得更為復雜。

多數的乳酸菌分離株都能耐4.0%和6.5%的NaCl[33]，其在質量分數為18%和6.5%的氯化鈉中的生長情況是鑒別其有關屬的一項重要指標[34]，因此NaCl濃度的大小也影響著乳酸菌生物膜的形成。在徐文生等[35]就NaCl 對長雙歧桿菌生物膜形成能力的影響研究中，表明一定濃度的Na+對形成生物膜有促進作用，該結果與任曉鏷等[36]對植物乳桿菌生物膜的研究結果一致。Knobloch 等[37]指出NaCl 能夠抑制用于阻止生物膜形成的icaR 基因的表達，還能激活用于誘導生物膜的形成SigB 和RsbU 因子，從而促進形成生物膜。

2.3 pH 對乳酸菌生物膜形成能力的影響

pH 值在微生物生物膜形成過程中有著非常大作用，有研究稱，pH 對生物膜的影響主要是通過影響電子轉移而產生的[38]，因而適合生物膜形成的pH 范圍極窄。對于乳酸菌來說，乳酸菌本身能夠產生乳酸，因此在pH 值偏酸性條件下，乳酸菌能夠生長并形成膜。任曉鏷等[26]、張國麗等[29]通過對乳桿菌進行研究，表明乳桿菌生物膜形成能力最強時的pH 值為5.5～6.8，在pH 值小于3.8 或大于6.8 時其生長及生物膜形成能力會受到明顯的抑制。在Lebeer S 等[39]對鼠李糖乳桿菌的研究中提及，pH 能夠通過影響鼠李糖乳桿菌的細胞表面，從而影響生物膜的發育，其研究結果顯示，鼠李糖乳桿菌在初始pH 為4.0 時其生物膜的形成會受到抑制。這些都說明了每種微生物都有最適合自身生長的pH 值，pH 值過高或過低都會產生不利影響，會導致微生物生長速率過慢，菌體產生數量過低，從而不易于膜的形成[33-37]。

2.4 不同食品添加劑對乳酸菌生物膜形成能力的影響

乳酸菌是食品中常見的益生菌，影響發酵食品的生成，而食品添加劑在食品發酵過程是必不可少的，因此添加不同的食品添加劑會對乳酸菌形成生物膜產生不同的影響。日常生活中最常用常見的食品添加劑是酸味劑和增稠劑，這些添加劑存在不僅使得食品的口感變得更好，還改變了發酵食品中微生物的生存環境。

在任曉鏷等[26]對戊糖乳桿菌生物膜形成因素的研究結果中表明，不同的食品添加酸及其不同濃度對乳酸菌的生長和生物膜的形成有著不同的影響。乳酸作為乳酸菌最主要的代謝產物，還用作食品中的酸味劑，它對食品有一定的防腐保鮮的功能，低濃度的乳酸就會抑制乳酸菌形成生物膜。但對于其他的酸味劑檸檬酸、蘋果酸、磷酸等，其體積分數必須達到一定程度才會影響乳酸菌的生長及其生物膜形成。

通常為了保持產品的形狀，會添加一定的增稠劑，明膠和果膠是最為常見的增稠劑，它們對乳酸菌生物膜的影響各不相同。在張國麗等[29]對植物乳桿菌生物膜形成條件的研究中表明，與明膠相比果膠對生物膜形成有著更強的促進作用。對于果膠來說，生物膜的形成量會隨著果膠添加量的增加而增加，但也會存在一個上限，當其添加量大于5.0 mg/mL 時，生物膜的形成量會開始降低。

3 結 語

生物膜的形成可以幫助菌體更好的適應環境，增強自身的免疫能力，幫助其對抗抗生素，從而免于被免疫系統所吞噬[40]。對于益生菌來說，生物膜的存在可以幫助有益微生物抵抗不利環境的脅迫[41]，除此之外，還可以通過生物膜的形成來進行益生菌的聚集，從而使發酵菌種具有更強的穩定性與活性，因此生物膜對于食品的加工和安全有極其重要的研究價值。本文通過對影響乳酸菌生物膜性形成的因素進行綜述，希望能為利用生物膜更好地增強乳酸菌的益生活性提供一定的理論依據和研究方向。