蛹蟲草液體培養和人工栽培方法優化研究

孫 楊 龔 丹 高福祥

沈陽華生生物科技開發有限公司 遼寧 沈陽 110000

蛹蟲草[Cordyceps militaris(L.)Link],又名北冬蟲夏草、北蟲草,在分類學上屬于子囊菌門(Ascomycota)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、蟲草科(Cordycipitaceae)、蟲草屬(Cordyceps)[1]。冬蟲夏草作為中國傳統滋補上品一直備受推崇,經現代科學研究表明,蛹蟲草含有與冬蟲夏草同類的營養物質,如蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、SOD和腺苷等等,甚至有些有效物質的含量較冬蟲夏草更高[2-5]。

目前在遼寧地區已實現大規模的蛹蟲草人工栽培,并取得了較為廣泛的群眾基礎。但在大規模栽培的過程中,仍存在優質菌種少、菌種遺傳不穩定、遺傳變異明顯以及退化風險大等問題,導致菌種生產不能滿足市場需求?；谏鲜鲈?筆者對自采菌種進行篩選,選擇性狀較優的菌株A170815作為實驗對象,在現有實踐經驗的基礎上分別對其液體培養和子實體栽培培養進行優化,篩選最適條件用于生產實踐,以期解決菌種市場的現有問題。

1 儀器與材料

SW—CJ—2DF型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司);立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業有限公司醫療設備廠);SHZ—A 旋轉氣浴恒溫振蕩器(杭州匯爾儀器設備有限公司);移液器(DRAGONLAB)。

馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)：葡萄糖2.0g、瓊脂2.0g,馬鈴薯浸汁定容至100 mL。(馬鈴薯浸汁：去皮馬鈴薯20.0g,加蒸餾水100 mL煮沸30 min,八層紗布過濾得浸汁。)

固體篩選培養基：碳源2%,氮源2%,VB1 0.005%,磷酸二氫鉀0.01%,硫酸鎂0.01%,瓊脂2%。

液體篩選培養基：碳源2%,氮源2%,VB1 0.005%,磷酸二氫鉀0.01%,硫酸鎂0.01%。

栽培基礎培養基：小麥40g,水72 mL。

菌種：自主采集并分離成功的菌株A170815。

2 方法

2.1 最適碳源和氮源及用量的篩選

2.1.1 固體平板初篩 將滅菌后的篩選培養基倒入無菌平皿中,靜置凝固后接入同一菌齡且同樣大小的菌塊,18-20℃,靜置暗培養,比較同樣培養時間下的菌落平均直徑。

2.1.2 液體搖瓶復篩 取同一菌齡且同樣大小的菌塊接種于滅菌后的液體篩選培養基中,18-20℃,搖床暗培養4-6天,比較菌絲量的多少。并將培養后的菌液接種于栽培基礎培養基上,進行出草驗證,比較子實體生長狀態和生物轉化率。

2.1.3 用量篩選 配制含有不同濃度碳源(或氮源)的篩選培養基,滅菌后倒入無菌平皿中,靜置凝固后接入同一菌齡且同樣大小的菌塊,18-20℃,靜置暗培養,比較同樣培養時間下的菌落平均直徑。

2.2 最適栽培料的篩選

2.2.1 液體菌種培養 在優選的液體培養基條件下接入菌種,18-20℃,搖床暗培養4-6天,得菌種培養液。

2.2.2 栽培料篩選實驗 分別用等量的小麥+水、燕麥+水、糙米+水、大米+水以及小麥+液體培養基組成栽培培養基,滅菌后接入同樣數量菌種培養液,進行出草驗證,比較子實體生長狀態和生物轉化率。

2.2.3 子代菌種驗證 在2.2.2步驟中的子實體生長至40-45天時,通過組織分離法[6-7]獲得子代菌種,將同一菌齡且同樣大小的子代菌塊重復2.2.1培養,獲得的培養液均接入栽培基礎培養基中,進行出草驗證,比較子實體生長狀態和生物轉化率。

3 結果

3.1 最適碳源和氮源及用量的篩選

3.1.1 碳源篩選：分別選用可溶性淀粉、蔗糖、白砂糖(食用級)、麥芽糖和葡萄糖作為碳源,蛋白胨為氮源,無碳源組為對照組,配制不同篩選培養基。接入同一菌齡且同樣大小的菌種塊,培養后比較菌落平均直徑,結果如圖1所示,由實驗結果可知蔗糖組菌落平均直徑最大。

圖1 不同碳源的固體篩選培養基上菌落平均直徑

不同的液體篩選培養基培養獲得的菌液中,蔗糖組、白砂糖組、葡萄糖組的菌絲量均較多,其次為可溶性淀粉組,麥芽糖組和無碳源組菌絲量明顯較少。將培養后的菌液接種于栽培基礎培養基上,進行出草驗證,對子實體生長狀態進行評價并測定生物轉化率,結果如圖2所示,由實驗結果可知蔗糖組表觀形態平均分最高且平均生物轉化率也最高。

圖2 不同碳源培養液子實體平均生物轉化率和表觀形態評價

通過固體平板初篩和液體搖瓶復篩并經栽培出草驗證,蔗糖組表現明顯優于其他組,所以確定蔗糖為最適碳源,后續實驗均采用蔗糖作為碳源。

分別以0、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%以及3%的蔗糖為碳源,蛋白胨為氮源,配制固體篩選培養基,接入同一菌齡且同樣大小的菌塊培養后測量菌落平均直徑,結果如圖3所示,蔗糖含量為2%時菌落最大,故確定蔗糖的最適濃度為2%。

圖3 不同蔗糖含量的固體篩選培養基上菌落平均直徑

3.1.2 氮源篩選：分別選用大豆蛋白胨、魚蛋白胨、牛肉蛋白胨、酵母蛋白胨和實驗室原用的蛋白胨作為氮源,蔗糖為碳源,無氮源組為對照組,配制不同篩選培養基。接入同一菌齡且同樣大小的菌塊,培養后比較菌落平均直徑,結果如圖4所示,由實驗結果可知無氮源組菌落直徑最大,但該菌落菌絲極薄且不轉色,故選擇酵母蛋白胨作為氮源繼續實驗。

圖4 不同氮源的固體篩選培養基上菌落平均直徑

不同氮源的液體篩選培養基培養獲得的菌液中,除無氮源組菌絲量較少外,其余各組的菌絲量均較多,單從菌絲數量上不易判斷孰優孰劣。將培養后的菌液接種于栽培基礎培養基上,進行出草驗證,對子實體生長狀態進行評價并測定生物轉化率,結果如圖5所示,由實驗結果可知酵母蛋白胨組表觀形態較好且平均生物轉化率也最高。

通過固體平板初篩和液體搖瓶復篩并經栽培出草驗證,酵母蛋白胨組表現優于其他組,所以確定酵母蛋白胨為最適氮源,后續實驗均采用酵母蛋白胨作為氮源。

分別以0、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的酵母蛋白胨為氮源,蔗糖為碳源,配制固體篩選培養基,接入同一菌齡且同樣大小的菌塊培養后測量菌落平均直徑,結果如圖6所示,酵母蛋白胨含量為0時菌落最大,但該菌落菌絲極薄且不轉色,故確定酵母蛋白胨的最適濃度為0.5%。

圖5 不同氮源培養液子實體平均生物轉化率和表觀形態評價

圖6 不同酵母蛋白胨含量的固體篩選培養基上菌落平均直徑

3.2 最適栽培料的篩選

3.2.1 栽培料篩選實驗 以蔗糖(2%)為碳源、酵母蛋白胨(0.5%)為氮源,其余組分同液體篩選培養基,配制液體培養基,接種培養獲得菌液。取同樣數量菌液接種于不同的栽培培養基中,經出草驗證,除大米組外,其余組子實體形態均較優,且小麥培養的子實體均較為粗壯,但生物轉化率組間差別較大,燕麥組最高可達163%,該組實驗子實體表觀形態平均分和生物轉化率如圖7所示。

圖7 栽培實驗子實體生物轉化率和表觀形態平均分

3.2.2 子代菌種驗證

2.2.2 步驟中子實體的子代菌種在轉色階段略有差異,大米組轉色差,其余組均正常。將子代菌種培養液接入栽培基礎培養基中,通過出草驗證可知,糙米和燕麥培養的子代表觀形態較優,且燕麥培養獲得的子代菌種生物轉化率仍最高,實驗結果如圖8所示。結合當代子實體綜合數據和子代子實體綜合數據認為燕麥+水組成的栽培培養基最適宜。

圖8 栽培實驗子代菌種子實體生物轉化率和表觀形態平均分

4 小結與討論

4.1 在液體培養時采用蔗糖(2%)作為碳源、酵母蛋白胨(0.5%)作為氮源,獲得培養液后栽培至燕麥和水組成的栽培培養基上,可以獲得綜合評價最高的子實體,且該菌株能夠將優勢保持至下一代,既保證了當代子實體的經濟價值又大大降低了菌種遺傳風險。

4.2 在碳源或氮源篩選中,固體平板篩選結果清晰明了但不能保證出草結果,而液體培養結果不易觀察但可結合栽培實驗明確出草結果,僅使用單一方法不能保證實驗結果的準確性,故采用固體平板初篩和液體搖瓶復篩結合的方法,增強實驗結果的可靠性。

4.3 在不同氮源含量篩選過程中,無氮源固體培養基上生長的菌落大、菌絲極薄且不轉色,與原始菌落和其他組差異極大。對該菌落進行了相關實驗,其能夠正常生長、出草和傳代,但與其他組別相比較,菌絲不夠強壯,后代變異風險較大。