Sirt5調控STAT3/Nanog信號通路抑制肝癌細胞的增殖和遷移

肖金成 康鑫鑫 朱文良 白淇文 李靖

1鄭州大學附屬腫瘤醫院微創介入科（鄭州450003）；2鄭州大學第一附屬醫院麻醉科（鄭州450052）；3廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院腫瘤內科二病區（南寧530011）

肝癌是我國發病率較高的惡性腫瘤之一，肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）為其主要類型［1］。盡管手術切除、肝臟移植、栓塞、消融、放射治療和化療已被應用肝癌治療，手術復發率高和5年生存率低等問題仍舊困擾著臨床醫生［2-3］。因此，尋找新的生物標志物或治療靶點以改善肝癌的診斷和結局至關重要。

組蛋白的乙酰化/去乙酰化修飾在基因表達調控中起重要作用。沉默信息調節因子2（silence information regulator2，Sir2）蛋白及Sir2 相關酶類（Sir2-related enzymes，Sirtuin）是一類依賴于NAD+、核心區域高度保守的組蛋白去乙酰化酶（參與蛋白乙酰化修飾）。哺乳動物的Sirtuin 家族有7 個成員：Sirt1～Sirt7。其中，Sirt5 定位于線粒體基質。研究［4］表明，Sirt5 缺乏會減少線粒體ATP 產生，并激活小鼠心臟中AMP 激活的蛋白激酶。在人肺癌細胞中，Sirt5 能夠將糖酵解過程的限速酶丙酮酸激酶2（pyruvate kinase M2，PKM2）去琥珀酰化，抑制Sirt5 表達可抑制肺癌細胞增殖［5］。Sirt5 失活還會導致線粒體絲氨酸羥甲基轉移酶2 去琥珀酰化，抑制絲氨酸分解代謝，進而抑制腫瘤生長［6］。這些發現提示Sirt5 在腫瘤發生和發展中發揮著重要作用。另一方面，研究表明肝部特異敲除Sirt6 會導致糖酵解和甘油三酯合成，從而導致脂肪肝形成［7］。Sirt3 低表達與肝癌預后差有關［8］。而Sirt5是否參與肝癌的進程及其可能的機制還有待進一步研究。本研究通過研究Sirt5 處理肝癌細胞后STAT3/Nanog 通路變化情況，揭示了Sirt5 對肝癌細胞增殖和遷移的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人肝癌細胞系HepG2、Huh7 及HepG3 培養于DMEM 培養基（含有10%胎牛血清、青霉素50 IU/mL、鏈霉素100 μg/mL），培養條件為37 ℃，5%CO2。1～2 d換液1次，細胞匯合度達90%后0.25%胰酶消化傳代。

1.2 細胞轉染及分組 將細胞分為4 組：Blank 組（正常培養的細胞），AAV 組（空載體病毒組），AAV-Sirt5 組（AAV-Sirt5 病毒組），Sirt5+Colivelin 組（AAV-Sirt5 病毒+0.5 μmol/L STAT3 激活劑Colivelin，美國Santa cruz 公司）。取對數生長期的肝癌細胞，以2 × 105個細胞/孔接種于6 孔培養板。待細胞融合至80%，換液并繼續培養6 h，將病毒原液按照感染復數（MOI）=20 加入培養液中，搖勻。24 h 后，去除病毒工作液并換液。繼續培養48 h，提取細胞蛋白，檢測Sirt5 的表達情況。

1.3 CCK-8 法檢測細胞增殖 待細胞匯合度約為80%，胰酶消化后進行計數。將細胞鋪于96 孔板中（2 × 105個/mL），每孔200 μL，培養箱中培養24后取出，每孔加入100 μL 含有10%CCK-8 試劑，繼續培養1.5 h 后用全自動酶標儀（波長為450 nm）檢測各孔吸光度（A）值。

1.4 Western Blot 檢測 用RIPA 裂解液裂解細胞，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。10%十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉法（120 V，2 h）將分離膠上的蛋白轉移到聚偏氟乙烯膜上，加入含5%脫脂奶粉的TBST 室溫1 h，加抗人Sirt5，抗人p-STAT3，抗人STAT3，抗人Nanog 及抗人β-actin一抗4 ℃孵育過夜。隨后加入兔抗人二抗室溫孵育1 h。ImageJ 軟件對目的條帶進行灰度值分析。

1.5 RT-PCR 待細胞匯合度約為80%，胰酶消化后進行計數。Trizol 試劑提取總RNA。使用PrimeScript RT reagent kit（Takara，中國）逆轉錄合成cDNA，然后使用SYBR Premix Ex Taq（Takara，中國）進行RT-PCR 反應。

1.6 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。所有實驗結果采用均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Sirt5 在肺癌細胞中的表達 與正常人肝細胞L02 相比，Sirt5 在肝癌細胞HepG2、Huh7 及HepG3的mRNA水平顯著降低（圖1A）。此外，Western Blot結果表明Sirt5 在肝癌細胞HepG2、Huh7 及HepG3的mRNA 水平顯著降低，其中以HepG2細胞水平最低，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖1B）。

圖1 各組Sirt5 表達水平Fig.1 Expression levels of Sirt5

2.2 過表達Sirt5 抑制HepG2 細胞增殖及遷移AAV-Sirt5 轉 染HepG2 細 胞，RT-qPCR 及Western Blot 結果均表明Sirt5 表達水平升高，說明Sirt5 腺相關病毒載體轉染成功（圖2）。CCK-8 實驗表明（圖3A），與Blank 組（1.00 ± 0.05）或AAV 組（1.03±0.04）相比，AAV-Sirt5組（0.42±0.04）細胞增殖能力顯著降低（P＜0.05），說明過表達Sirt5 能夠顯著抑制HepG2 細胞增殖。細胞遷移實驗表明，過表達Sirt5 能夠顯著抑制HepG2 細胞遷移能力（圖3B）。

圖2 Sirt5 表達水平Fig.2 Expression levels of Sirt5

2.3 Sirt5 過表達抑制STAT3/Nanog 信號通路為了進一步研究Sirt5 抑制HepG2 細胞增殖及遷移的機制，本研究對細胞中STAT3 的水平進行了檢測。研究也表明，與Blank 組或AAV 組相比，過表達Sirt5 會顯著降低p-STAT3 和Nanog 的相對表達水平，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖4）；而STAT3 激活劑colivelin 的加入顯著逆轉了Sirt5 對STAT3 的抑制作用（P＜0.05）。CCK-8 及細胞遷移實驗也表明與AAV-Sirt5 組相比，Sirt5+Colivelin 組細胞增殖和遷移能力顯著升高（圖3）。

3 討論

圖3 過表達Sirt5 對細胞增殖和遷移的影響Fig.3 Effects of Sirt5 on cell proliferation and migration

圖4 STAT3 和Nanog 表達水平Fig.4 Expression levels of STAT3 and Nanog

Sirtuin 是一個高度保守的去乙酰化酶家族蛋白家族。Sirtuin 具有廣泛的生理功能，并在調控衰老和壽命方面發揮重要的作用。但目前科學家對于Sirtuin 家族成員在腫瘤發生中的作用存在爭議。研究表明Sirt7 在HCC 癌癥組織中上升，并促進HCC 細胞生長，其缺失使細胞周期停留在G1［9］。而Sirt4 在結直腸癌中具有抑制癌癥的功能［10］。Sirt5 是Sirtuin 家族的一員，定位于線粒體中。Sirt5缺乏賴氨酸去乙酰化酶活性（微弱），但擁有NAD依賴的去丙二酰化酶活性。研究［11］表明Sirt5 可催化賴氨酸去琥珀酰化。當蛋白質超琥珀酰基化時，一些代謝信號通路遭到破壞，包括肝臟中脂肪酸累積以及酮體生成減少。Sirt5 參與多種癌癥的發展進程。在人肺癌細胞中，Sirt5 能夠將糖酵解過程的限速酶PKM2 去琥珀酰化；在Sirt5 缺失的細胞中，PKM2 琥珀酰水平增加，其丙酮酸激酶活性下降，抑制Sirt5 表達可抑制肺癌細胞增殖［5］。在非小細胞肺癌患者中，Sirt5 高表達，并與預后差有關［12］。Sirt5 可靶向作用于核因子E2 相關因子2（細胞抗氧化程序中的主要轉錄調控因子），其敲除會抑制非小細胞肺癌細胞生長［12］。過表達Sirt5可減小異檸檬酸脫氫酶（IDH1）超琥珀酰化，抑制神經膠質瘤的惡性生長［13］。但Sirt5 在HCC 患者中的作用和機制還有待進一步確認。本研究表明，Sirt5 在肝癌細胞系HepG2、Huh7 及HepG3 均降低，而在HepG2 中水平最低。這可能與肝癌細胞的侵襲能力（HepG2 的侵襲能力小于Huh7 和MHCC97H）有關。本研究的成果與WANG 等［8］的研究結果相似，即在HCC 患者癌癥組織中，Sirt5 低表達。CHEN［14］等近期也揭示Sirt5 能通過抑制過氧化物酶體誘導的氧化應激，抑制HCC 發展。

白介素6/STAT3 是HCC 干細胞更新和增殖的主要信號通路［15］。研究［16］發現，在肺癌細胞系中Sirt5 去乙酰化STAT3，從而抑制STAT3 在線粒體丙酮酸代謝中的作用。本研究也表明過表達Sirt5可以抑制STAT3 的磷酸化及Nanog 蛋白表達。用STAT3 特異性激活劑colivelin 激活STAT3 消除了Sirt5 對細胞增殖和遷移的抑制作用，表明STAT3/Nanog 信號通路在調節Sirt5 介導的HCC 細胞增殖和遷移中起著重要的作用。Nanog 是一種自我更新基因，可維持胚胎干細胞的多能性［17］。研究［18］表明，STAT3/Nanog 通路在肝臟腫瘤干細胞中被激活，導致致瘤性和干性。JSI-124（一種STAT3 信號轉導通路抑制劑）可有效地抑制惡性腦膠質母細胞瘤干細胞的增殖及形成神經球的能力［19］。提示Sirt5 可能通過調節HCC 干細胞更新和增殖調節HCC 發展。

綜上所述，本研究表明Sirt5 在肝癌細胞系中低表達，過表達Sirt5 可以抑制HepG2 細胞增殖及遷移能力，而此過程可能與抑制STAT3/Nanog 信號通路有關。以上研究結果揭示Sirt5 能夠通過調節STAT3/Nanog 通路抑制肝癌發展，且Sirt5 有望成為治療肝癌的靶標分子。未來將著重于Sirt5 對HCC細胞干性的影響及在動物模型中探討Sirt5 下調是否會推動HCC 的起始和進展。