基于LAMP技術針對溶藻弧菌gyrB基因快速檢測方法的建立

陳昌國，陳秋圓，侯兵兵，劉新萍,董優優

（解放軍總醫院第六醫學中心檢驗科，北京 100048）

溶藻弧菌是一種常見的嗜鹽性革蘭氏陰性弧菌，有較強的適應性和抗逆性，廣泛分布于海水及河口入海處，其數量在海洋各類弧菌中居于首位[1-3]。溶藻弧菌由Miyamoto在1961年命名，其生物學特性與副溶血弧菌有較多相似之處，是水生動物弧菌病的主要病原菌之一[1,4-5]。此外，溶藻弧菌不但會引起多種人類感染性疾病，如傷口感染、食物中毒及中耳炎等，嚴重時可引起敗血癥危及生命[6-9]；而且，該菌是沿海地區感染性腹瀉和食物中毒的主要病原菌之一，其作為致病菌的相關研究日益受到重視[10-11]。

目前，分子生物學檢測溶藻弧菌的靶點有16s rRNA 基因、colH基因、dnaJ40基因以及hsp60基因等[10]。雖然16s rRNA 基因是細菌分子系統鑒定的“金標準”，但其進化上的過度保守不利于區分相似種，而更適用于種以上水平的鑒定[12-13]。gyrB即促旋酶（gyrase）B亞基，其在細菌中廣泛存在，與16sRNA相比，gyrB基因進化速度更快且在近乎全部細菌中呈單拷貝形式，更適用于細菌種的鑒定。在弧菌中gyrB基因具有較高同源性，不同弧菌之間具有明顯遺傳距離，其穩定準確區分不同弧菌的特點使得它可以作為檢測的靶點[14]。本實驗以溶藻弧菌gyrB基因為研究對象，基于LAMP技術建立一種溶藻弧菌的快速檢測方法，實驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 實驗使用的菌株包括：溶藻弧菌ATCC-17749（由李艷君博士提供）、溶藻弧菌野生株-WT (由本科室分離并保存)、糞腸球菌ATCC-29212、金黃色葡萄球菌ATCC-25293、腐生葡萄球菌ATCC-BAA750、霍氏腸桿菌ATCC-700323、銅綠假單胞菌ATCC-27853、大腸埃希氏菌ATCC-25922菌株均為本科室保存。

1.2 試劑和儀器 普通恒溫水浴，凝膠電泳儀均是本科室常用設備。0.1mmol/L MgSO4溶液，10×Reaction Buffer,Solution Mix, Bst DNA聚合酶均購自New England Biolabs公司，特異性引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，后期處理按照引物合成單說明進行操作,引物序列見表1。

表1 gyrB基因LAMP引物序列

1.3 方法

1.3.1 細菌核酸粗提物制備：將菌種從-80℃冰箱取出后快速復溫并接種在TCBS、哥倫比亞血平板上，將平板置孵箱中37℃培養12h，取適量細菌至含有100μl核酸裂解液的EP管中，室溫裂解15min,中間渦旋振蕩3次，100℃恒溫金屬浴加熱10min， 1 3000r/min室溫離心5min,取上清作為模板。

1.3.2 LAMP反 應 體 系：10×Bst r/min buffer 2.5 μl,MgSO4(25mmol/L) 1.2μl，dNTP (10mmol/L) 1.6 μl，內引物各0.8μmol，外引物各0.2μmol，Bst DNA聚合酶 (8 U/μl) 1μl，DNA模板2 μl，ddH2O 15.7 μl。

1.3.3 反應溫度的優化：將相同反應混合液在不同的溫度下(60，61，62和63℃）反應60min，80℃滅活5min，取5μl反應產物在2g/dl凝膠中進行電泳，以出現清晰明顯條帶的反應溫度為優，確定最佳反應溫度。

1.3.4 反應時間的優化：將相同反應混合液在61℃分別反應60 min和90 min，然后80℃滅活5 min，將反應產物在2g/dl凝膠中進行電泳，以出現條帶的清晰程度判斷反應時間對擴增效果的影響。

2 結果

2.1 不同溫度下擴增效果的比較 凝膠電泳結果見圖1。不同反應溫度獲得的擴增效果不一，61℃條件下得到的gyrB擴增產物電泳條帶最清晰明顯，提示61℃為適宜反應溫度。

圖1 不同溫度gyrB基因LAMP擴增產物凝膠電泳結果

2.2 不同反應時間擴增效果的比較 見圖2。在61℃反應60 min和90 min擴增效果相差不大，反應條件使用60min反應時間即可滿足實驗要求。

圖2 不同反應時間gyrB基因LAMP擴增效果

2.3 特異性評價 使用優化后的LAMP反應體系對溶藻弧菌野生株、溶藻弧菌標準菌株及其它6種常見致病細菌的標準株進行擴增，電泳結果顯示僅溶藻弧菌標準菌株和溶藻弧菌野生株有gyrB基因陽性擴增條帶，其它6種常見致病細菌標準株均無擴增條帶，見圖3。提示該反應體系的特異度較好。

圖 3 溶藻弧菌標準菌株、溶藻弧菌野生株及其它種細菌gyrB基因擴增條帶

2.4 靈敏度評價 將溶藻弧菌標準株提取的核酸母液進行系列稀釋作為擴增反應模板，當濃度為102mg/L～10-4mg/L時，每個濃度均有gyrB陽性擴增條帶，當濃度為10-5mg/L時未出現gyrB擴增條帶。所以，該反應體系的檢測靈敏度為10-4mg/L，與我們前期Taqman熒光定量PCR結果相比[20]具有較好的靈敏度，見圖 4。

圖4 不同濃度核酸gyrB基因的LAMP擴增結果

3 討論

溶藻弧菌是海水中最常見的優勢弧菌，既是海水養殖動物的重要致病菌，也是多種人類疾病的致病菌，對水產養殖業以及人類健康有著重要影響[15]。目前，溶藻弧菌的檢測主要是傳統的微生物鑒定方法和常規的分子生物學方法。傳統培養鑒定檢測方法完成一個鑒定周期用時較長且步驟繁瑣；常見的分子生物學方法如普通PCR、熒光定量PCR等不但需要PCR儀且對場地和人員的操作要求相對較高，不利于在條件相對簡陋的條件下展開工作[16]。環介導等溫擴增（LAMP）技術是由NOTOMI等[17]于2000年報道的一種核酸等溫擴增技術，其原理是針對靶基因的6個位點設計2對特異性引物（內、外引物各一對），應用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶（Bst DNA酶）通過鏈置換方式進行高效擴增，具有高特異度、高靈敏度、簡便、快速、低成本及對儀器要求低的特點，已廣泛應用于微生物、病毒、寄生蟲等多種領域[18-19]。

本研究中通過在線軟件針對gyrB基因設計了LAMP引物，首先將反應體系在不同溫度條件進行反應，2g/dl凝膠電泳結果顯示61℃的反應條件下擴增產物的條帶最為清晰，效率較高；在確定了反應條件后我們對反應時間的長短進行了優化，2g/dl凝膠電泳結果顯示在最佳反應溫度下反應60 min的效果即能滿足后續實驗的要求并不需要延長反應時間來提高擴增效率。確定反應溫度及反應時間后，我們對該方法的特異度和敏感度進行了評估。該體系在特異性檢測中溶藻弧菌標準株和溶藻弧菌野生株擴增結果為陽性，其它菌株擴增結果為陰性，可以有效地對溶藻弧菌及其它6種常見致病菌進行區分，具有較好的特異度；在敏感度檢測中當溶藻弧菌標準株核酸模板濃度為102～10-4mg/L時，每個濃度均出現陽性擴增條帶，當模板濃度降低到10-5mg/L時未出現陽性條帶，說明該體系檢測的靈敏度為10-4mg/L。

綜上所述，我們基于LAMP技術建立了一種以gyrB基因為分子靶點的快速、簡便、準確的溶藻弧菌檢測方法，對溶藻弧菌的快速檢測具有重要意義。