中國漢族結直腸癌患者UGT1A1*28基因多態性分析

滕祥云，王新夢，劉 維，樊 慧，李 琦

(長沙三濟生物科技有限公司,長沙 410205)

結直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，在我國結直腸癌的死亡率位于全部惡性腫瘤死亡率的前6位，對人類健康產生嚴重影響[1]。伊立替康是一種治療轉移性結直腸癌的特效藥，與氟尿嘧啶聯合使用，可以延長結直腸癌患者的生存期[2]。但是，伊立替康因其毒副作用的影響(尤其是嚴重的延遲性腹瀉以及骨髓抑制)，使用受到一定的限制。而引起伊立替康產生毒副作用發生的機制可能與遺傳基因多態性有關。

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(uridine diphosphate glucuronosyltransferase，UGT)是 體 內重要第II相生物轉化代謝酶，分為UGT1和UGT2兩個家族。UGT1A1啟動子區存在大量的TA堿基重復序列(TA6或TA7)，隨著TA重復序列數目的增加，UGT1A1表達下降，將導致伊立替康代謝產物SN-38在體內過度蓄積，從而引發嚴重的毒副反應[3]。美國食品藥品監督管理局(FDA)在伊立替康和UGT1A1的標簽中表明，UGT1A1*28純合基因型(TA7/ TA7)使用伊立替康進行治療時，中性粒細胞減少增加。

有研究發現，UGT1A1 基因多態性的分布在不同種族間存在明顯差異[4]，為進一步明確中國漢族結直腸癌人群UGT1A1*28位點基因多態性的分布特點及差異，本研究采用焦磷酸測序技術對505例漢族結直腸癌患者UGT1A1*28的基因多態性進行檢測，比較不同性別、年齡段及地區漢族結直腸癌患者中UGT1A1*28基因型分布特點，為結直腸癌人群的UGT1A1*28基因篩查及個體化用藥提供理論依據，有效減少臨床延遲性腹瀉以及骨髓抑制等不良事件的發生。

1 材料與方法

1.1 研究對象 505例結直腸癌患者的臨床樣本來自全國49家醫療機構于2016～2017年送檢的血液標本，每份樣本均通過病理檢查確診。其中，男性311例，平均年齡58.10±11.19歲；女性194例，平均年齡56.19±11.73歲。

1.2 試劑與儀器 DNA提取試劑盒、測序反應通用試劑盒(長沙三濟生物科技有限公司)；焦磷酸測序試劑、 Qiagen PyroMark Q24 焦磷酸測序儀(德國凱杰公司)；PCR擴增引物和焦磷酸測序引物(上海捷瑞生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取：按照DNA提取試劑盒說明書進行。

1.3.2 引物設計：見表1。采用PyroMark Assay Design Software2.0(德國凱杰公司)軟件設計PCR引物和焦磷酸測序引物。

表1 UGT1A1*28 位點的引物序列

1.3.3 焦磷酸測序法檢測UGT1A1*28的基因多態性 ：按照儀器和試劑盒說明書進行PCR擴增、焦磷酸測序，并通過Qiagen PyroMark Q24(德國凱杰公司)軟件對測序結果進行分析，根據出峰的堿基和峰高判斷UGT1A1*28的基因型。

1.4 統計學分析 應用SPSS18.0統計軟件處理數據，計量資料采用均數±標準差(±s)表示，計數資料以頻數表述，組間比較采用 χ2檢驗或Fisher精確檢驗，Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗采用Person χ2檢驗。

2 結果

2.1 PCR產物測序結果 采用焦磷酸測序技術，檢測UGT1A1*28基因多態性，其代表性結果見圖1。

圖1 UGT1A1*28焦磷酸測序結果

2.2 UGT1A1*28基因型分布情況 UGT1A1*28的3種基因型分布頻率為TA6/TA6：74.26%，TA6/TA7：22.97%，TA7/TA7：2.77%，等位基因的分布頻率為TA6：85.74%，TA7：14.26%，檢測結果符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=1.84，P ＞ 0.05)。

2.3 中國漢族結直腸癌患者UGT1A1*28基因型和等位基因分布 505例結直腸癌患者中，UGT1A1*28野生型(TA6/TA6)、雜合型(TA6/TA7)、突變純合型(TA7/TA7)頻率分別為74.26%，22.97%和2.77%。通過對不同性別、年齡段以及地區UGT1A1*28基因型和等位基因數據進行分析發現，基因型分布和等位基因分布與患者性別、年齡以及地區之間差異無統計學意義(P ＞ 0.05)，見表2。

3 討論

UGT1A1基因位于染色體2q37，是尿苷酸二磷酸葡萄醛酸轉移酶中的一員，其基因產物的主要作用是醛酸化各種外源性藥物以及內生底物葡萄糖，使其更好地被清除，包括伊立替康、膽紅素等。伊立替康(Irinotecan, CPT-11)，是一種DNA拓撲異構酶I抑制劑，是目前治療轉移性結直腸癌最有效的化療藥物之一[5]，主要在肝臟內進行代謝，形成活性代謝產物7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN-38)，SN-38的細胞毒性大大增強，從而導致毒副作用的發生。UGT1A1是伊立替康的重要代謝酶，該基因位點存在50多種基因多態性，其中以UGT1A1*6和UGT1A1*28與伊立替康療效和安全性研究為主[6-7]，UGT1A1*28啟動子區存在大量的TA堿基重復序列，隨著TA重復序列數目的增加，UGT1A1酶活性下降，使得SN-38在體內蓄積，從而引發嚴重的毒副反應[3]。2005年FDA批準UGT1A1*28用于預測伊立替康的不良反應。

結直腸癌是一種世界范圍的消化道常見惡性腫瘤，發病率位于第三位[8]。在我國，結直腸癌的發病率約為37.6/10萬，死亡率約為19.1/10萬[9]，并且呈現上升趨勢，成為中國社會重要的健康負擔，尤其是在較為發達的省份[10]。以往研究表明UGT1A1*28基因多態性與伊立替康療效及不良反應密切相關，并且UGT1A1*28基因多態性有地域和種族差異。本次研究中中國漢族結直腸癌患者中UGT1A1*28 的3種基因型發生率與國內漢族人群相關報道結果一致[11-12]。UGT1A1*28的基因型分布頻率為TA6/TA6：74.26%，TA6/TA7：22.97%，TA7/TA7：2.77%，等位基因的分布頻率為TA6：85.74%，TA7：14.26%。UGT1A1*28的3種基因型及兩種等位基因分布與中國漢族結直腸癌患者的性別、年齡、地區差異無關。但在新疆維吾爾族人群[13]中， TA6與TA7兩種等位基因的頻率分別為30.93%和69.07%，兩者之間存在差異性。與國外研究相比，泰國[14]UGT1A1*28基因頻率分布與我國相似，沙特阿拉伯[15]、秘魯和墨西哥[16]TA7等位基因頻率高于我國。由此可知，UGT1A1*28基因頻率存在種族差異性，相比于白種人，TA7等位基因在中國人群中的頻率較低。

綜上所述，UGT1A1是伊立替康重要的代謝酶，UGT1A1*28基因多態性可以預測伊立替康不良反應，但是UGT1A1*28在白種人群中突變率較高，而在中國人群中突變率較低，在對中國人使用伊立替康治療時，是否需要檢測UGT1A1*28多態性，尚無一致的定論。本次研究還存在很多局限性，本次研究結果還需要更廣泛的地區，更大的樣本量進一步驗證。