CaBP4基因突變與兒童癲癇的相關(guān)性研究

張玲如，周美寧，肖 珊（.陜西省友誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，西安 70068；

2.西安高新醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，西安 710075）

癲癇屬于一種次常見的小兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其發(fā)病原因主要受多種因素影響，易引發(fā)腦功能障礙綜合征[1]。有研究指出[2]，癲癇病理基礎(chǔ)主要是腦細(xì)胞群放電異常，與腦能量代謝異常緊密相關(guān)。臨床癲癇診斷主要依靠CT和MRI等技術(shù)診斷顯示癲癇患兒發(fā)病時(shí)腦電生理、結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變，但不能有效反映腦細(xì)胞代謝和功能變化[3]。遺傳學(xué)和生物學(xué)研究指出[4]，神經(jīng)元細(xì)胞核中編碼離子通道基因突變會(huì)影響膜通道蛋白發(fā)生改變，從而導(dǎo)致通道性質(zhì)以及結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這一變化與癲癇發(fā)病有關(guān)。基因異常會(huì)影響離子通道作用，有研究指出[5]，編碼神經(jīng)元離子通道基因突變與癲癇綜合征有關(guān)。基因異常會(huì)促進(jìn)興奮性神經(jīng)因子釋放，增加離子通道功能，減輕神經(jīng)遞質(zhì)作用，進(jìn)而引發(fā)癲癇。鈣連接蛋 白4（Ca2+-bingding protein 4，CaBP4）是一種類似于鈣調(diào)節(jié)蛋白的神經(jīng)元鈣連接蛋白，主要作用和鈣調(diào)節(jié)蛋白相似，對(duì)電門控鈣離子通道、瞬間受體電位蛋白通道等起到調(diào)節(jié)作用，同時(shí)對(duì)神經(jīng)元和其他可興奮性細(xì)胞鈣信號(hào)電位有增加效果[6-7]。臨床數(shù)據(jù)顯示[8]，CaBP4基因突變與2B型先天性靜止性夜盲癥具有相關(guān)性。KHAN 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CaBP4蛋白屬于鈣連接蛋白家族中的一員，主要存在于視感受器突觸末端中，受Cav1.4通道的影響，CaBP4基因突變會(huì)導(dǎo)致先天性靜止性夜盲癥發(fā)生，CaBP4蛋白表達(dá)水平降低是先天性靜止性夜盲癥發(fā)病的重要原因。本文旨在研究CaBP4基因突變與小兒癲癇臨床特點(diǎn)的相關(guān)性，為小兒癲癇的臨床診斷和治療提高數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 本文選取2016年3月～2018年3月在我院就診的額葉癲癇兒童60例，男性35例，女性25例，年齡1～12歲，平均年齡6.3±2.1歲。根據(jù)發(fā)作類型分為簡(jiǎn)單部分性發(fā)作21例，強(qiáng)直-陣攣發(fā)作15例，復(fù)雜部分性發(fā)作17例，肌陣攣發(fā)作4例，強(qiáng)直性發(fā)作3例；根據(jù)發(fā)作程度分為輕度25例，中度14例，重度21例。患兒癲癇2個(gè)月發(fā)作1次為輕度癲癇，1個(gè)月發(fā)作＜4次為中度癲癇，1個(gè)月內(nèi)發(fā)作＞4次，并且為持續(xù)狀態(tài)為重度癲癇。

納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患兒均經(jīng)過(guò)腦電圖、MRI等檢查確診為癲癇；所有患兒均符合2001年國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟以及中國(guó)癲癇的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]；發(fā)病前智力運(yùn)動(dòng)發(fā)育正常患兒。

排除標(biāo)準(zhǔn)：血細(xì)胞檢測(cè)以及尿代謝異常患兒；進(jìn)行抗癲癇藥物治療患兒；發(fā)病前智力運(yùn)動(dòng)發(fā)育異常患兒；并發(fā)顱內(nèi)感染、先天性腦發(fā)育畸形、遺傳代謝疾病患兒。本文研究患兒家屬均知情，簽署知情通知書，經(jīng)過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑 DNA提取試劑盒（北京天漠科技開發(fā)有限公司），限制性內(nèi)切酶（TaKaRa公司），PCR擴(kuò)增試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司），電泳試劑盒（赫澎生物上海科技有限公司）；電泳緩沖液（上海哈靈生物科技有限公司），紫外線凝膠成像分析系統(tǒng)（南京世研儀器設(shè)備有限公司）等。

1.3 研究方法

1.3.1 臨床相關(guān)資料統(tǒng)計(jì)：由專門醫(yī)護(hù)人員統(tǒng)計(jì)癲癇患兒的性別、首發(fā)病年齡、月發(fā)作頻率、發(fā)作程度（輕度、中度、重度）、發(fā)作類型（簡(jiǎn)單部分性發(fā)作、復(fù)雜部分性發(fā)作、強(qiáng)直-陣攣發(fā)作、肌陣攣發(fā)作、強(qiáng)直性發(fā)作）等臨床特征。

1.3.2 CaBP4基因突變分布：按照DNA提取試劑盒提取患者外周血DNA，置于-20℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩０碢CR擴(kuò)增試劑盒配置反應(yīng)體系15μl，后利用擴(kuò)增儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增， PCR反應(yīng)條件：94℃環(huán)境預(yù)處理5min，94℃變性處理30s，60℃退火30s，72℃延伸處理30s，72℃終末延伸5min，總計(jì)循環(huán)30次。酶切：酶切酶為FastDigest Csp6I，試劑添加為Csp6I 0.8μl，緩沖液1.6μl，加入13.6μl三蒸水，將16μl混合液混入8μl DNA產(chǎn)物中，37℃水浴5min后80℃水浴滅活10min。依據(jù)瓊脂糖凝膠電泳試劑盒進(jìn)行電泳處理及測(cè)序：使用2g/dl瓊脂糖凝膠電泳，電壓150V，時(shí)間45min，后利用紫外線凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行基因分型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。計(jì)數(shù)資料采用n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)； CaBP4基因突變與癲癇患兒臨床特征的相關(guān)性分析采用多因素Logistic回歸分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CaBP4基因突變率分布情況 60例癲癇患兒中，CaBP4基因p.G155D突變陽(yáng)性患者33例，突變率為55.0%；CaBP4基因未突變患兒27例，未突變率為45.0%。

2.2 CaBP4基因突變與小兒癲癇臨床資料的關(guān)系 60例癲癇患兒中，CaBP4基因p.G155D突變患兒男性20例（60.6%），女性13例（39.4%），首發(fā)病年齡3.2±0.8歲；CaBP4基因未突變患兒男性15例（55.6%），女性12例（44.4%），首發(fā)病年齡6.3±1.6歲。兩組間比較CaBP4基因突變與小兒癲癇性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.156，P=0.693）；與小兒癲癇首發(fā)病年齡有關(guān)，CaBP4基因p.G155D突變患兒首發(fā)病年齡低于CaBP4基因未突變患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.752，P＜0.000）。

2.3 CaBP4基因突變與小兒癲癇月發(fā)作頻率和發(fā)作程度的關(guān)系 60例癲癇患兒中，CaBP4基因p.G155D突變患兒月發(fā)作頻率4.5±1.0次，發(fā)作程度：輕度9例（27.3%）、中度8例（24.2%）、重度16例（48.5%）；CaBP4基因未突變患兒月發(fā)作頻率2.1±0.5次，發(fā)作程度：輕度16例（59.3%）、中度6例（22.2%）、重度5例（18.5%）。兩組間比較CaBP4基因突變與小兒癲癇月發(fā)作頻率和發(fā)作程度均有關(guān)， CaBP4基因p.G155D突變患兒月發(fā)作頻率高于CaBP4基因未突變患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.352，P＜0.000）；CaBP4基因p.G155D突變患兒重度發(fā)作率高于CaBP4基因未突變患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.482，P=0.024）。

2.4 CaBP4基因突變與小兒癲癇發(fā)作類型的關(guān)系 見表1。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，CaBP4基因p.G155D突變患兒其簡(jiǎn)單部分性發(fā)作率、復(fù)雜部分性發(fā)作率、強(qiáng)直-陣攣發(fā)作率高于CaBP4基因未突變患兒，肌陣攣發(fā)作率、強(qiáng)直性發(fā)作率低于CaBP4基因未突變患兒，組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.962，P=0.041）。

表1 CaBP4基因突變對(duì)癲癇患兒發(fā)作類型的影響[n（%）]

2.5 CaBP4基因突變與癲癇患兒臨床特征的多因素回歸分析 見表2。分析發(fā)現(xiàn)，CaBP4基因突變與癲癇患兒的首發(fā)病年齡、月發(fā)作頻率、發(fā)作程度及發(fā)作類型有關(guān)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而與癲癇患兒性別無(wú)關(guān)（P＞0.05）。

表2 CaBP4基因突變與癲癇患兒臨床特征的多因素回歸分析

3 討論

癲癇屬于神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病，其發(fā)病具有遺傳性。額葉癲癇是一種特發(fā)性癲癇，在兒童期、青少年早期易發(fā)病，其主要發(fā)作起源是額葉的叢集性發(fā)作，其發(fā)作與睡眠有關(guān)。研究指出患兒在睡眠期2期時(shí)常為癲癇發(fā)作，主要表現(xiàn)為過(guò)度運(yùn)動(dòng)發(fā)作[11]。通過(guò)臨床神經(jīng)系統(tǒng)診斷，患者智力表現(xiàn)正常，有較少的患者出現(xiàn)精神輕度損傷[12]。研究指出，基因異常會(huì)影響機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，調(diào)控神經(jīng)元分化、發(fā)育，而基因突變會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元產(chǎn)生異常的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，從而導(dǎo)致癲癇發(fā)作[8，13]。CaBP4基因位于染色體11q13.2，全長(zhǎng)為828bp，包括6個(gè)外顯子編碼區(qū)，編碼產(chǎn)物由275個(gè)氨基酸的CaBP4組成[14]。CaBP4蛋白參與視感受器突觸的發(fā)育和生長(zhǎng)，在神經(jīng)元的L型鈣通道以及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放起到促進(jìn)作用[12，15]。

本研究結(jié)果顯示，60例額葉癲癇患兒中，CaBP4基因p.G155D突變陽(yáng)性患者為33例，其突變率為55.0%。說(shuō)明額葉癲癇中p.G155D突變型是CaBP4基因突變的主要型。LITTINK 等[16]研究指出，CaBP4基因突變主要與2B型先天性靜止性夜盲癥有關(guān)。而本研究探究發(fā)現(xiàn)CaBP4基因突變與小兒癲癇性別無(wú)關(guān)，說(shuō)明癲癇患兒的年齡與CaBP4基因p.G155D突變無(wú)關(guān)。小兒癲癇首發(fā)病年齡低于CaBP4基因未突變患兒，說(shuō)明CaBP4基因p.G155D突變與患兒的首發(fā)年齡有關(guān)。李丹等[17]在研究中指出，SCNIA基因突變與Dravet綜合征患兒發(fā)病年齡有關(guān)，SCN1A基因突變陽(yáng)性患兒發(fā)病年齡較早。本文研究也證實(shí)，額葉癲癇患兒發(fā)病與CaBP4基因p.G155D突變陽(yáng)性有關(guān)。曾琦等[18]在研究中指出，SCN2A基因突變主要在新生兒期或嬰兒早期起病，說(shuō)明SCN2A基因突變與首發(fā)病年齡有關(guān)。

本研究中，CaBP4基因p.G155D突變患兒月發(fā)作頻率高于CaBP4基因未突變患兒，重度發(fā)作CaBP4基因p.G155D突變患兒高于CaBP4基因未突變重度患兒，說(shuō)明CaBP4基因突變與小兒癲癇月發(fā)作頻率和發(fā)作程度有關(guān)。同時(shí)研究結(jié)果顯示，CaBP4基因p.G155D突變患兒其簡(jiǎn)單部分性發(fā)作率、復(fù)雜部分性發(fā)作率及強(qiáng)直-陣攣發(fā)作率顯著高于CaBP4基因未突變患兒，說(shuō)明CaBP4基因突變與小兒癲癇發(fā)作類型有關(guān)。趙瀅等[19]研究顯示，在ARX基因突變患兒中，主要是早發(fā)性癲癇腦病患兒，主要發(fā)作類型為部分性發(fā)作及痙攣發(fā)作，并且患兒的智力運(yùn)動(dòng)發(fā)育顯著落后，甚至嚴(yán)重倒退。本文通過(guò)對(duì)癲癇患兒首發(fā)病年齡、月發(fā)作頻率、發(fā)作程度、發(fā)作類型進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，CaBP4基因p.G155D突變主要與額葉癲癇患兒的首發(fā)病年齡、月發(fā)作頻率、發(fā)作程度、發(fā)作類型有關(guān)，其中首發(fā)病年齡早、月發(fā)作頻率高、發(fā)作程度重、簡(jiǎn)單部分性發(fā)作、復(fù)雜部分性發(fā)作、強(qiáng)直-陣攣發(fā)作的癲癇患兒CaBP4基因p.G155D突變率較高。

綜上所述，CaBP4基因p.G155D突變，癲癇患兒首發(fā)病年齡越早、月發(fā)作頻率越高、發(fā)作程度越嚴(yán)重，癲癇發(fā)作類型不同，CaBP4基因p.G155D突變率存在差異。為小兒癲癇的臨床診斷和治療提供數(shù)據(jù)支持。