廣州市第一人民醫(yī)院新生兒病區(qū)金黃色葡萄球菌毒力基因分布分析

王 蓉，陳紫茹，唐露丹，楊 瀟（廣州市第一人民醫(yī)院檢驗科，廣州 510180）

新生兒感染是造成新生兒院內(nèi)死亡的主要原因。新生兒免疫系統(tǒng)發(fā)育不夠成熟、皮膚屏障作用較弱使其易受細(xì)菌的侵襲。加之某些基礎(chǔ)疾病如早產(chǎn)、窒息等的影響，使新生兒對微生物感染的易感性更高。眾多病原菌中，金黃色葡萄球菌是引起新生兒感染最常見的致病菌[1-2]。

金黃色葡萄球菌產(chǎn)生多種毒力因子，在病原體侵入并抵抗宿主的防御機(jī)制過程中發(fā)揮重要作用，是引起疾病、導(dǎo)致器官損傷的重要因素[3]。然而，目前的研究多集中于細(xì)菌的耐藥性研究，對毒力基因，尤其是新生兒分離的金黃色葡萄球菌的研究進(jìn)行的較少。因此，本研究旨在了解廣州市第一人民醫(yī)院新生兒病區(qū)的金黃色葡萄球菌的毒力基因的分布情況，揭示其分子流行特征，為建立有效防控措施奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2018年6月～2019年4月從廣州市第一人民醫(yī)院新生兒病區(qū)分離到的金黃色葡萄球菌22株。其中10株分離自傷口分泌物，6株分離自結(jié)膜分泌物，5株分離自痰，1株分離自皮膚分泌物。標(biāo)本收集嚴(yán)格按照廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會要求進(jìn)行。

1.2 試劑和儀器 革蘭染液為江門凱琳公司產(chǎn)品。DNA提取試劑為QIAGEN公司產(chǎn)品。細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀Vitek Ⅱ COMPACT為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。PCR儀為美國伯樂公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 引物合成：本研究選取金黃色葡萄球菌重要的9個毒力基因，即黏附素[纖維蛋白原結(jié)合蛋白（clfa），膠原蛋白結(jié)合蛋白（cna），纖連蛋白連接蛋白A（fnbpA）]、溶血素A，B（hlaA, hlaB）基因、金黃色葡萄球菌A蛋白（spa）基因、mecA基因、表皮剝脫素（eta）基因和中毒性休克綜合征毒素（tsst-1）基因。引物序列參照文獻(xiàn)[4]合成。

1.3.2 DNA提取：將收集的金黃色葡萄球菌接種到血平板37℃過夜培養(yǎng)，挑取菌落至裂解液中制成菌懸液。將菌懸液置于100℃干式恒溫器上加熱10min，然后冰浴5min，12 000r/min離心10min，取離心后的上清液作為PCR擴(kuò)增的模板。

1.3.3 毒力基因的檢測：采用PCR法檢測毒力基因的表達(dá)情況。反應(yīng)程序為預(yù)變性95℃ 5min，變性95℃ 1min，復(fù)性49℃ 30s，延伸72℃ 1min，共30個循環(huán)，最后延伸72℃ 10min。同時設(shè)置蒸餾水為陰性對照，加入金黃色葡萄球菌16sDNA作內(nèi)參。取PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液混合，點入1mg/dl瓊脂糖凝膠，用水平式電泳槽5v/cm電泳20min，凝膠成像系統(tǒng)成像并記錄。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示，毒力基因間比較用四格表資料的χ2檢驗和R×C表的χ2檢驗，以P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新生兒病區(qū)金黃色葡萄球菌毒力基因檢測結(jié)果 見表1。22株新生兒病區(qū)金黃色葡萄球菌9個毒力基因中，clfa，hlaA檢出率較高，分別為68.18%和63.64%，其后依次為spa基因，cna基因，mecA基因和fnbpA基因，eta基因，hlaB基因和tsst-1基因的檢出率低于10%，不同基因檢出率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=240.21，P =0.000）。

表1 新生兒病區(qū)金黃色葡萄球菌毒力基因分布情況（n=22）

2.2 金黃色葡萄球菌毒力基因檢測組合模式 見表2，圖1。22株金黃色葡萄球菌中，有6株未檢測出本次實驗所選擇的9種毒力基因。在檢出的16株中，表達(dá)3種及以上毒力基因的菌株為14株，占87.50%。clfa+hlaA+spa+cna的毒力基因陽性模式檢出率最高，占25.00%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=69.607，P =0.000）。

表2 金黃色葡萄球菌毒力基因表達(dá)模式及比例（n=16）

2.3 不同標(biāo)本類型毒力基因分布情況 見表3。新生兒病區(qū)22株金黃色葡萄球菌中有4種標(biāo)本來源。由于僅1株是來自皮膚分泌物，因此未對此標(biāo)本類型進(jìn)行分析。對3種主要標(biāo)本來源分別統(tǒng)計分離得到的金黃色葡萄球菌毒力基因檢出率，其中，clfa，hlaA在3種類型標(biāo)本中的檢出率差異無統(tǒng)計學(xué) 意 義（clfa: χ2=2.436, P=0.296; hlaA: χ2=1.391, P =0.499）。eta基因僅在傷口分泌物中檢出，hlaB基因僅在痰標(biāo)本中檢出，tsst-1基因僅在結(jié)膜分泌物中檢出，提示此3個基因在不同部位致病中發(fā)揮作用。

圖1 部分分離株毒力基因PCR擴(kuò)增電泳圖M：DNA marker；1：clfa；2：cna；3：eta；4：fnbpA；5：hlaA；6：hlaB；7：mecA； 8：spa；9：tsst-1

表3 不同標(biāo)本來源金黃色葡萄球菌毒力基因檢出率分析

3 討論

細(xì)菌毒力在細(xì)菌所致的感染性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。病原菌的毒力是由多種毒力基因共同決定的。這一現(xiàn)象在金黃色葡萄球菌的致病中更為典型，其有包括黏附素、溶血素、mecA等多種毒力基因，分別在其黏附、抗吞噬、誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥方面發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)黏附素基因和溶血素基因檢出率均超過60%。這一結(jié)果提示，本院新生兒病區(qū)分離到的金黃色葡萄球菌主要以這兩類毒力基因表達(dá)為主，但與王冬梅等[6-8]研究結(jié)果相比檢出率較低。本次研究，spa基因的檢出率為59.09%，低于JAHANSHAHI等[4-5]的研究結(jié)果。表皮剝脫毒素基因（eta）和中毒性休克綜合征毒素基因（tsst-1）的檢出率最低，均小于10%，與王冬梅等[6,9]的研究基本一致，但比JAHANSHAHI等[4]較低。這些毒力基因檢出率的差異，可能與樣本量、患者年齡、標(biāo)本來源等因素有關(guān)。新生兒的免疫功能低，易于感染，故毒力較低即可以致病，而成人免疫功能完善，需要較高的致病性才能引起宿主疾病，從而使成年人感染的金黃色葡萄球菌毒力基因檢出率較高。

本研究中，檢測出3個及以上毒力基因的菌株占87.50%。因此，提示本院新生兒病區(qū)金黃色葡萄球菌流行株大都攜帶多個毒力基因。在毒力基因表達(dá)模式方面，本研究發(fā)現(xiàn)clfa+hlaA+spa+cna模式檢出率最高，與王冬梅等[6]研究不同，可能與病人的年齡、標(biāo)本來源構(gòu)成等因素有關(guān)。同時，本研究發(fā)現(xiàn)不同的標(biāo)本來源的金黃色葡萄球菌，其毒力基因模式卻并不完全一致（表3），這也提示與不同毒力基因在金黃色葡萄球菌致不同部位的損傷有關(guān)，尚需進(jìn)一步研究確認(rèn)。

本研究發(fā)現(xiàn)了一個耐藥性基因型和表型的差異現(xiàn)象。本次研究檢測出6株金黃色葡萄球菌含有mecA基因，但藥敏結(jié)果僅報告了1株MRSA。提示基因的攜帶不是與表型簡單的一一對應(yīng)，在某些情況下可能是多個基因聯(lián)合作用的結(jié)果。在MRSA的檢測中，可能需要通過PCR擴(kuò)增mecA，femB等多個耐藥相關(guān)基因，或使用乳膠凝集法檢測PBP2a表達(dá)情況確定是否為MRSA。

綜上所述，本研究對廣州市第一人民醫(yī)院新生兒病區(qū)金黃色葡萄球菌毒力基因分布情況進(jìn)行了分析，得到了第一手?jǐn)?shù)據(jù)。后續(xù)還需進(jìn)一步增加樣本量，并將毒力基因表達(dá)模式與臨床病理相聯(lián)系，為進(jìn)一步提高本院新生兒感染性疾病的診治奠定基礎(chǔ)。