慢性乙肝患者血清Tim-3，HBsAg，TGF-β1水平表達與病情程度相關性研究

劉宗萍（陜西省寶雞市口腔醫院檢驗科 陜西寶雞 721000）

近年來，慢性乙肝患者患病率呈逐年上升趨勢，由于疾病初期無特異性臨床表現，故診斷困難，所以血清學指標檢測在慢性乙肝患者疾病中的診療價值得到普遍關注[1-2]。為了研究血清學指標在慢性乙肝患者中的表達情況，本課題首先對所選取研究對象轉化生長因子β1（TGF-β1），T淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（Tim-3）和乙肝表面抗原（HBsAg）表達進行分析，進一步對上述指標在慢性乙肝患者與正常患者中的表達水平及慢性乙肝患者與血清學指標進行Logistic分析，同時對上述指標與研究對象肝功能指標進行相關性分析，初步研究TGF-β1，Tim-3和HBsAg單項檢測及聯合檢測對慢性乙肝患者檢測的能效分析。通過本次研究旨在對慢性乙肝患者相關血清水平檢測進行進一步的探討。經查閱文獻發現，當前臨床并未發現關于上述指標與慢性乙肝病情評估中綜合應用價值的系統性研究，基于此，本研究通過比較慢性乙肝患者和健康人群Tim-3，HBsAg和TGF-β1水平，探討Tim-3，HBsAg和TGF-β1與疾病病情程度間的關聯性及診斷價值，以期為疾病臨床診斷提供新的思路及途徑。報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取我院2017年10月～2019年6月收治的慢性乙肝患者103例作為研究組，另選取同期健康體檢者103例作為對照組。納入標準：研究組符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》中慢性乙肝診斷標準[7]；年齡＜60歲；知曉本研究，簽署同意書。排除標準：并發肝癌、肝內巨大血管瘤、肝內膽管結石；藥物性肝損傷；哺乳期及妊娠期女性 ；并發免疫功能異常；并發全身性感染性病變、血液系統及代謝系統病變；納入研究前3個月內采取抗病毒及免疫調節治療。研究組男性56例，女性47例；年齡39～58歲，平均年齡48.06±4.91歲；病情程度：輕度28例，中度43例，重度32例。對照組男性59例，女性44例；年齡36～59歲，平均年齡47.89±5.10歲。兩組性別、年齡等基線資料均衡可比（P＞0.05），且本研究經我院倫理委員會審批通過。

1.2 試劑和儀器 美國Bio-RAD公司Bio-RAD550型酶標儀，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司酶聯免疫試劑，美國雅培公司Abbott Architect I2000型全自動化學發光免疫系統與配套試劑。

1.3 方法 兩組均于入院后第2天空腹狀態下抽取靜脈血5 ml，3 000 r/min，離心10 min，取上清液，置于-20℃環境中儲存待檢，以酶標儀經酶聯免疫吸附法測定肝功能指標（CG，ALT，AST，DBIL和TBIL）水平、TGF-β1水平；采取全自動化學發光免疫系統與配套試劑，經化學發光微粒子免疫法測定HBsAg表達情況；取新鮮肝素鋰抗凝外周全血100μl，置于流式管內，加入PE-Tim-3，FITCCD8，APC-CD3熒光單克隆抗體，于4℃環境中避光孵育30 min，加入溶血素1 ml于室溫下避光10 min，待其成真性溶液，離心處理，經PBS洗滌2次，以PBS 300μl重懸處理，經流式細胞儀測定Tim-3表達情況。

1.4 統計學分析 數據處理使用SPSS 24.0軟件包，肝功能指標及TGF-β1，Tim-3及HBsAg以均數±標準差（±s）表示，t檢驗。敏感度、特異度、準確度以n（%）表示，χ2檢驗。慢性乙肝發病影響因素采用Logistic回歸分析，血清各指標水平與慢性乙肝肝功能的關聯性采用Pearson相關性分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝功能指標比較 見表1。通過對兩組患者肝功能指標進行比較，研究組患者血清CG，ALT，AST，DBIL和TBIL表達水平均高于對照組，差異有統計學意義（t=24.412～53.782，均P＜0.05）。

表1 兩組患者血清CG，ALT，AST，DBIL和TBIL水平比較（±s）

表1 兩組患者血清CG，ALT，AST，DBIL和TBIL水平比較（±s）

項 目 研究組（n=103） 對照組（n=103） t P CG（mg/L） 30.53±6.44 1.89±0.51 44.993 ＜0.001 ALT（U/L） 245.33±40.81 27.41±5.06 53.782 ＜0.001 AST（U/L） 160.27±25.76 31.29±4.41 50.087 ＜0.001 DBIL（μmol/L） 6.56±1.10 2.44±0.68 32.333 ＜0.001 TBIL（μmol/L） 22.69±5.91 8.28±0.98 24.412 ＜0.001

2.2 TGF-β1，Tim-3及HBsAg水平比較 見表2。研究組TGF-β1，Tim-3和HBsAg水平高于對照組，差異均有統計學意義（t=29.878～37.574，均P＜0.05）。

表2 兩組患者TGF-β1，Tim-3及HBsAg水平比較（±s）

表2 兩組患者TGF-β1，Tim-3及HBsAg水平比較（±s）

項 目 研究組（n=103） 對照組（n=103） t P TGF-β1（pg/ml） 71.13±10.18 28.79±6.44 35.672 ＜0.001 Tim-3（%） 24.44±6.06 4.70±2.87 29.878 ＜0.001 HBsAg（ng/ml） 3.83±1.01 0.09±0.02 37.574 ＜0.001

2.3 慢性乙肝發病影響因素的多元回歸分析 見表3。以慢性乙肝發病作因變量，將性別、年齡、TGF-β1，Tim-3及HBsAg水平作自變量進行Logistic回歸分析，結果顯示患者乙肝發病與性別（OR=1.527），年齡（OR=1.959）均屬于獨立危險 因 素(χ2=0.145～0.238，P＞0.05),而 患 者HBsAg（OR=2.234），Tim-3（OR=2.634） 及TGF-β1（OR=2.768）均為影響慢性乙肝發病的獨立危險因素（χ2=5.862～11.140，均P＜0.05）。

表3 慢性乙肝患者發病影響因素Logistic分析

2.4 TGF-β1，Tim-3，HBsAg與肝功能指標關聯性分析 見表4。通過對TGF-β1，Tim-3及HBsAg與CG，ALT，AST，DBIL，TBIL進行相關性分析，TGF-β1，Tim-3及HBsAg與ALT，AST，DBIL，TBIL均存在顯著正相關關系（r=0.698～0.822,均P＜0.05）。

表4 TGF-β1，Tim-3及HBsAg與肝功能指標關聯性分析

2.5 TGF-β1，Tim-3和HBsAg單獨及聯合診斷效能 見表5。TGF-β1，Tim-3和HBsAg的 敏感度、特異度、準確度在單獨診斷時結果之間差異無統計學意義（χ2=3.241，2.145，P ＞0.05），聯合診斷時敏感度、特異度、準確度均高于單獨診斷，聯合診斷與單獨診斷結果經統計學分析，差異有統計學意義（χ2=9.662～22.685，均P＜0.05）。

表5 TGF-β1，Tim-3，HBsAg及聯合診斷效能對比[%（n）]

3 討論

由于在慢性乙肝發病機制中，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染可促使機體免疫系統活化，生成大量細胞因子，而宿主免疫功能狀態在疾病發病機制中具有關鍵作用，可通過免疫應答對宿主自身細胞因子進行調節[8-10]。因此相關因子檢測對慢性乙肝檢測成為一個研究重點，Tim-3為近年來新發現的一類負性免疫調控因子，在腫瘤、自身免疫性病變、感染性疾病發生中均具有重要作用[11]。Tim-3通過和配體半乳糖凝集素-9（Galectin-9）結合后于調節性T細胞(Treg)活化過程中增加Tim-3蛋白表達水平，Tim-3水平增加可誘導Th1細胞凋亡并抑制Th1型免疫反應，從而調節慢性乙肝患者Th1/Th2平衡[12-13]。而Th1/Th2平衡與慢性乙肝患者病情程度的關聯性具有重要意義[14]。張華琳等[15]研究表明，慢性乙肝患者Tim-3蛋白表達水平可以作為慢性HBV感染者病情變化的監測指標之一。這與本次研究Tim-3蛋白表達水平檢測結果一致。而劉霞[16]研究指出，慢性乙肝患者外周血Tim-3表達水平顯著高于健康組，且重度患者Tim-3表達水平較輕度患者更高。這與本研究研究組Tim-3水平高于對照組結果一致，這也提示Tim-3參與了慢性乙肝發生及進展過程。

TGF-β1可代表Treg特性及功能，在免疫調節反應中具有重要作用，其高表達狀態可影響機體內HBV病毒的清除。臨床研究表明，TGF-β1為肝纖維化關鍵介導因子，其可增加膠原基因表達、促使成纖維細胞生成，造成細胞外基質異常合成及堆積[17]。同時，學者黃國棟等[18]指出，TGF-β1水平在慢性乙肝早期即可異常增高，有望成為疾病早期診斷指標。DENG等[19]認為，TGF-β1可促使肝細胞損傷壞死、凋亡，其能作用于肝星狀細胞，促使其轉化為肝纖維母細胞，并合成大量膠原，加速肝纖維化進程。徐愛靜等[20]研究結果表明，慢性乙肝患者TGF-β1表達水平明顯增高，且和免疫失衡狀態、肝纖維化具有密切關聯性。操偉慶等[21]研究顯示，慢性乙肝患者血清TGF-β1含量較正常水平明顯增高，其參與了肝臟損傷及病情進展。本研究也表明，研究組TGF-β1水平高于對照組，與上述結果具有一致性，表明TGF-β1在疾病發生及進展中具有重要作用。此外，HBsAg為慢性乙肝治療效果的重要評估指征，其定量監測結果和慢性乙肝患者肝細胞核中HBV DNA含量關系密切，能反映肝臟中共價閉合環狀DNA表達情況[22]。同時，HBsAg還可直接反映機體免疫功能狀態[23]。但既往多是分析HBsAg在慢性乙肝治療效果評估中的應用價值，徐少華等[24]學者證實，HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者血清定量值可以作為慢性乙型肝炎血清學轉換且不會因為輸血等因素而進行變化，是一種較穩定的檢測標志物，提示我們HBsAg血清表達作為診斷慢性乙肝的輔助指標之一，具有高穩定性。

在臨床檢測中，CG，ALT，AST，DBIL和TBIL均為臨床評估肝臟功能的指標，若肝臟發生壞死或變性等損傷，則此類指標水平可出現明顯異常。而本研究中，我們通過檢測血清CG，ALT，AST，DBIL和TBIL水 平 與Tim-3，HBsAg，TGF-β1進行相關性分析，結果表明肝功能指標與Tim-3，HBsAg，TGF-β1間存在顯著正相關，且上述血清指標聯合診斷敏感度、準確度等顯著高于單獨診斷。表明通過聯合檢測Tim-3，HBsAg，TGF-β1表達情況，不僅能提高慢性乙肝診斷準確性，最大程度降低漏診及誤診風險，且可為肝功能的準確評估提供較為全面的檢測方式，以此指導臨床調整治療方案，保證治療有效性及針對性。綜上所述，慢性乙肝患者Tim-3，HBsAg，TGF-β1水平在疾病發生及進展中可以作為慢性乙肝進展的檢測指標，通過聯合檢測Tim-3，HBsAg，TGF-β1水平，可有效提升慢性乙肝診斷敏感度、準確度及特異度，從而提升檢測準確率。本次研究由于納入樣本量過小及不具備大型實驗室的研究規范，此項研究可作為參考，以期望后期有大樣本研究，為疾病臨床診斷提供新的思路及途徑。