濃香型大曲白酒窖泥微生物研究進展

江 鵬，何朝玖，劉燕梅，尚娟芳，蘭小艷，肖龍泉

（1.宜賓職業技術學院 五糧液技術學院，四川 宜賓 644003；2.宜賓市六尺巷酒業有限公司，四川 宜賓 644000；3.宜賓市產品質量監督檢驗所，四川 宜賓 644002；4.成都大學 藥學與生物工程學院，四川 成都 610106）

白酒是世界六大蒸餾名酒之一，由于白酒的釀造工藝不同和地理環境的差異，形成了多種香型的白酒，其中以濃香型白酒的產量和銷量最大。濃香型白酒以糧谷為主要原料，以中高溫大曲為糖化發酵劑，采用泥窖固態法發酵，經蒸餾，陳釀，勾兌而成，以己酸乙酯為主體香。濃香型大曲白酒生產的一個重要特征就是泥窖固態發酵，這就使得濃香型白酒對窖池依賴程度較大，然而窖池的功能載體是窖泥，窖泥中微生物的優劣對濃香型白酒生產至關重要。優質老窖才能生產好酒[1-3]，長時間的馴化與選擇，孕育了窖池中獨特的窖泥微生物群落。它們既相互共生，又相互競爭，通過復雜的相互作用關系，形成了一個穩定的生態系統。窖泥是白酒固體發酵過程中微生物的重要來源，是影響白酒的口感與品質的重要因素。因此，對窖泥中微生物的研究具有十分積極的意義和深遠的影響。本文將對濃香型窖泥微生物研究中常用的技術方法進行介紹，并綜述濃香型窖泥微生物研究進展，以期為窖泥生產和養護提供理論參考。

1 窖泥的概述

濃香型白酒是一類以泥窖固態發酵生產的白酒，泥窖尤其是人工泥窖大多采用黃黏土筑窖。白酒工作者對濃香型白酒生產實踐經驗的高度凝練和總結——千年窖池萬年糟，窖池越老酒越香。在一定范圍內窖泥的質量與濃香型大曲酒的質量存在一定關系，即窖泥越老，大曲酒的質量越高。窖泥中的主要功能微生物是在長期的發酵過程中篩選出來的，它們的群落結構對濃香型白酒的香味有較大的影響。窖泥微生物之間存在共生、互生及競爭等多種種群關系，長期的白酒生產使窖泥微生物的種類逐漸穩定[4]，同時產香味物質的功能微生物數量也呈上升趨勢。目前研究發現新窖泥以乳桿菌為主，而老窖泥以梭菌綱、擬桿菌綱和產甲烷菌綱為主[5]。

2 窖泥微生物的研究技術

以往關于窖泥微生物的研究多基于純培養的方式，從可培養的角度研究微生物群落和動態變化，分離和鑒定新型窖泥微生物，為濃香型白酒功能菌的篩選及菌種庫的建立提供依據。隨著微生物生態學的發展，分子生物學等先進技術越來越多地應用于窖泥微生物鑒定、群落組成解析等研究，使得對窖泥微生物認識越來越深入。

2.1 傳統窖泥微生物研究技術

傳統窖泥微生物研究方法是平板分離純化及鑒定技術，該鑒定技術包括傳統的菌落形態、生理生化以及對核酸序列對微生物分類。然而窖泥中能夠采用平板分離培養的微生物僅占窖泥微生物的一部分。目前運用傳統平板僅能分離得到可培養的微生物，對窖泥微生物的深入研究的意義不大。已證明表現型相同的微生物可能是一群有相同的生理特征或形態特征的微生物，這樣是不足以明確分類的[6]。雖然傳統窖泥微生物研究技術對窖泥微生物的研究存在不足，但厭氧培養、純培養技術和傳統的微生物鑒定技術為白酒生產起到了重要的推動作用[7-8]。黃治國等[9]從濃香型窖泥中分離純化得到5株細菌，并用傳統微生物鑒定系統鑒定了其中一株細菌。劉燕梅等[10-11]應用傳統微生物分離方法從濃香型窖泥中分離研究了窖泥微生物的生理特性。雷光電等[12]通過對瀘州老窖酒廠不同窖齡窖泥中5大功能菌群的數量和生態結構研究，發現窖泥功能微生物的數量隨窖齡增加而增加。以純培養方法對窖泥中的微生物研究由來已久。傳統純培養技術在窖泥研究中仍被廣泛使用，這主要是由于該技術可以研究特定微生物的理化特征，分離得到的功能微生物可應用于白酒生產。

2.2 現代窖泥微生物研究技術

隨著微生物研究技術的發展，分子生物學技術越來越多地應用于窖泥微生物鑒定、群落組成解析等研究[13]。現代分子生物技術具有不需培養、快速準確、靈敏度高等特點，對窖泥微生物的研究更加深入，現代分子生物技術可將窖泥微生物在種屬水平上進行系統分析，對窖泥的實際生產和養護不僅可以提供理論指導，還能解決窖泥退化和老化問題。

2.2.1 磷脂脂肪酸指紋圖譜技術在窖泥微生物研究中的應用

磷脂是大多數微生物（古生菌除外）細胞膜中相對穩定的成分，且含量相對比較穩定，只有微生物死亡后，磷酯類化合物才會迅速分解[14]。不同種類的微生物細胞膜上的磷脂脂肪酸組成及含量存在顯著差異，即特定的特征脂肪酸僅存在特定的微生物中[15]。如：脂肪酸15∶0，a15∶0，i15∶0，10Me18∶0 等用來表征放線菌[16-18]。磷脂脂肪酸技術不需要酸15∶0，17∶0，18∶1ω7 等用來表征細菌；脂肪酸16∶0，18∶2ω6等用來表征真菌；不分離培養即可獲得微生物群落信息，適合微生物群落的研究。該技術主要是提取脂肪酸結合常見微生物的磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）譜圖數據庫和利用氣相色譜即可完成對微生物的鑒定，操作簡便、結果較為可靠，能定量描述環境樣品中的微生物群體[19-21]。近年來，磷脂脂肪酸技術在窖泥微生物的研究中得到廣泛應用。PLFA指紋圖譜技術分析法可簡單歸納為：（1）提取磷脂脂肪酸；（2）氣相色譜分析，獲得PLFA譜圖；（3）通過譜圖的變化得到微生物結構變化情況。ZHAO J S等[22-23]采用磷脂脂肪酸指紋圖譜技術對窖泥微生物進行了研究，結果表明厭氧細菌和真菌是窖泥中的優勢菌群。李永博等[24]采用磷脂脂肪酸指紋圖譜技術研究30年、100年的窖泥發現，100年窖齡的窖泥微生物比30年窖齡的豐富，細菌是窖泥的優勢菌群。

2.2.2 克隆文庫技術在在窖泥微生物研究中的應用

克隆文庫是通過獲得窖泥樣品總脫氧核糖核酸（deoxyribose nucleic acid，DNA），以提取到的總DNA為模板聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增微生物的16S rDNA基因，然后將得到的擴增產物與載體連接，轉化感受態細胞，通過藍白斑篩選，挑取陽性克隆進行測序，根據測序結果判斷樣品中的微生物信息，由于克隆文庫針對原核微生物的16S rDNA全長，且避開了傳統的純培養方法，能將一些對營養要求苛刻的微生物鑒定出來，因此能更全面的反映樣品中的微生物多樣性；由于采用該方法能獲取微生物的16S rDNA全序列，所以結果也更加準確。王明躍等[25-26]以克隆文庫技術對不同窖齡窖泥古菌進行研究，研究結果表明，通過16S rDNA克隆文庫技術能夠系統地認識了不同窖齡窖泥細菌群落的基本構成及演替規律。窖泥微生物在50年前后變化明顯，50年之前窖泥中古菌種群結構變化較大；50年之后，古菌群落結構趨于穩定。葉光斌等[27]以克隆文庫技術對瀘州地區濃香型窖泥原核微生物群落結構進行研究，研究結果表明，梭菌綱為窖泥內細菌群落的絕對優勢種群，除此之外還存在一定比例的芽孢桿菌綱、擬桿菌門、柔膜菌門和互養菌門的分布。此外該研究還首次發現在瀘州老窖窖泥內可能存在與甲烷菌共生的嚴格厭氧的梭菌綱類群的存在。盡管通過克隆文庫法對窖泥的研究取得了一些成果，但該技術仍有不足，如操作繁瑣，且耗時耗力等。

2.2.3 PCR-DGGE技術在窖泥微生物研究中的應用

變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術最初用于檢測DNA中的點突變，后來逐漸用于環境微生物多樣性的分析，如活性污泥、海洋、土壤等方面的微生物群落研究[28]。溫度、pH等外界因素可以使DNA分子由雙鏈變性為單鏈。聚合酶鏈反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術原理是利用不同DNA分子解鏈難易程度以及在聚丙烯酰胺電泳中遷移受分子質量和電荷的影響程度不同而實現分離[29]。該技術無需培養、直接提取總DNA分析的微生物多樣性具有簡便快速、結果準確，在白酒微生物的研究中起著重要作用。黃志國等[30-31]采用PCRDGGE技術及測序技術研究了不同窖泥細菌群落結構及多樣性變化趨勢，結果發現窖齡越長，細菌群落結構越穩定。鐘姝霞等[32]通過PCR-DGGE技術研究了不同窖齡窖泥中主要微生物群落結構與窖泥理化指標之間的關系，研究結果表明窖泥的理化指標和微生物群落結構變化有極大相關性。盧振等[33]應用PCR-DGGE技術分析了不同性狀窖泥的細菌群落，結果表明，窖泥中優勢微生物包含擬桿菌門、放線菌門、變形菌門和厚壁菌門4個門類，其中新窖泥中微生物最豐富，涵蓋上述門類，假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌科（Enterobacterale），里氏桿菌屬（Riemerella）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）為新窖泥特有的優勢微生物。雖然PCR-DGGE具有免培養，檢測快速、準確等優勢，是白酒窖泥微生物群落結構的主要研究方法之一，但對一些數量低的窖泥微生物不能有效地檢測出[34]。由于PCR-DGGE技術的優勢明顯，在白酒窖泥微生物群落的研究中有著重要影響，隨著技術的發展，PCR-DGGE技術會不斷優化，與其他現代生物技術結合，揭示窖泥微生物的“秘密”。

2.2.4 高通量測序技術在窖泥微生物研究中的應用

DNA測序是指測定組成DNA分子的核苷酸的排列順序[35]。傳統的測序方法是采用Sanger發明的末端宗旨測序法[36]，也稱第一代測序法。該測序方法操作費力，且通量低、成本高，于是科學家們開發的二代測序技術，也叫高通量測序技術。該技術對微生物群落結構明顯優勢，能全面客觀地揭示目標環境中微生物群落信息，同時獲得定性及相對定量信息等優勢[37]。現已被廣泛的應用于窖泥及其他樣品中微生物的多樣性研究。趙東等[38]利用高通量測序技術解析五糧液窖泥原核微生物的群落結構，研究結果表明五糧液窖泥與其他區域的濃香型窖泥微生物群落結構存在顯著差異。羅雯等[39]采用高通量測序技術對不同性狀窖泥微生物組成研究，結果表明新窖泥、趨老化泥及老化窖泥中微生物分布特征較為相似，老窖泥與趨于老熟窖泥的微生物群落結構一致。劉博等[40]基于高通量測序技術解析濃香型白酒中窖泥臭味物質4-甲基苯酚的來源，研究表明4-甲基苯酚來源的主要微生物是梭狀桿菌（Clostridium）。栗連會等[41]采用16S rRNA基因的高同量測序技術比較了窖泥中乳酸菌群落結構，研究表明發酵過程酒醅中存在49種乳酸菌，其中16種來源于大曲，3種來源于窖泥。鄧杰等[42]采用高通量測序技術對濃香型白酒不同窖齡窖池窖泥中古菌群落結構分析，研究發現窖泥古菌多樣性與窖齡呈負相關。

2.2.5 宏基因組技術在窖泥微生物研究中的應用

宏基因組學技術（又稱微生物原基因組技術）是利用現代基因組技術直接以環境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，分析微生物多樣性、種群結構以及進化關系的現代分子生物技術[43-46]。僅靠傳統培養法和傳統分子生物技術很難研究清楚窖泥微生物以及窖泥微生物之間的相互關系[47]，大多數窖泥微生物是不能單獨分離培養的，宏基因組技術測序周期短、測序通量大、靈敏度高，能對樣品中總的微生物群落結構進行功能及代謝通路的分析[48]。

濃香型大曲白酒的發酵方式是泥窖固態發酵，在窖泥中存在著大量難以分離培養的窖泥微生物，他們的發酵機制及種群關系研究還不夠深入，因而對窖泥微生物尤其是發酵機制和種群關系的研究具有重要意義。而宏基因組技術不需要對菌株進行分離而直接就可以研究窖泥微生物。徐資靜等[49]利用宏基因組學技術研究劍南春糟醅細菌多樣性特征，研究發現細菌種類和數量與糟醅層數有關，糟醅層從上到下，微生物的數量和種類逐漸減少。

3 結論與展望

在濃香型大曲白酒固態發酵過程中逐漸形成了復雜的窖泥微生物群落，微生物菌群相互作用和獨特的生產工藝形成了濃香型大曲白酒窖香濃郁、綿甜爽烈的風格特征。由于窖泥中的釀酒微生物群落結構的復雜性，以及部分微生物難于分離培養，使得對窖泥微生物的研究提出了更高的要求。近年來，隨著現代分子生物技術在窖泥中的應用，對窖泥微生物的研究越來越深入。主要集中在窖泥微生物群落多樣性和窖泥微生物群落的演替及窖泥微生物群落結構與窖泥質量關系等方面的研究[49-51]。運用現代化的儀器設備和現代分子生物技術（克隆文庫、DGGE、測序技術等）揭開了窖泥微生物的部分面紗：窖泥中的微生物種類與窖泥的質量關系極大，老熟窖泥中的優勢微生物有擬桿菌門、放線菌門、變形菌門和厚壁菌門等4個門類，其中放線菌可以作為一種判斷窖泥老熟與老化的指示菌[44]。雖然現代分子生物技術已大量應用于窖泥微生物的研究，但是傳統微生物學技術對窖泥微生物的研究仍占有重要的地位。總之，要完全認識窖泥微生物還存在較多技術瓶頸和壁壘。為進一步掌握白酒窖泥微生物與窖泥質量以及在代謝上的關系，宏基因組學、微生物代謝組學等現代分子生物技術將有助于加深對窖泥微生物代謝活動的認識和了解窖泥微生物群落代謝機制，有助于解決白酒生產中遇到的實際問題，以便生產更多優質的濃香型大曲白酒。