ACE抑制肽的研究進展

趙 越，張孚嘉，吳 楠，雙 全

（內蒙古農業大學 食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

世界衛生組織將高血壓列為人群健康的頭號危險因素，它是引起全世界人口死亡率上升的主要病因，約影響15%～20%的成年人的健康[1]。2010年，高血壓導致940萬人死亡，占全球傷殘死亡率的7.0%。據估計在2030年，將會導致2 330萬人死亡[2]。心血管疾病有關的治療費用約高達1 060億歐元，約占整個歐盟醫療支出總額的9%，給社會帶來了很大的經濟負擔。據報道，全世界大約有2/3的高血壓患者生活在發展中國家，特別是亞洲國家，其高血壓人數的增長率最高。高血壓是引起流行性心血管疾病（中風、心肌梗塞、心臟病等）的主要病因之一，47%的冠心病和54%的腦中風患者是由高血壓引起的[3]。成人高血壓占比為30%～45%，且隨著年齡的增長患病人數急劇增加。高血壓的典型定義是血壓在140/90 mmHg以上的水平，血壓值120～139/80～89 mmHg與低于120/80 mmHg的血壓水平相比，前者心血管疾病發病率和死亡率大幅增加[4]。雖然高血壓的控制與多種代謝途徑有關，但血管緊張素轉換酶的調節是一個關鍵調控因素。

1 ACE抑制肽的研究歷史及作用機制

1.1 ACE抑制肽作用機制

血管緊張素轉換酶（angiotensin-I converting enzyme，ACE）是從人體組織和體液中發現的一種二肽羧肽酶，在人體心血管系統中起著至關重要的作用。ACE通過將血管緊張素I轉化成血管緊張素Ⅱ來提高血壓。血管緊張素轉化酶抑制肽（Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides，ACEI）是通過抑制血管緊張素Ⅱ的合成或促進緩激肽的釋放，抑制ACE活性從而降低血壓。ACE主要有兩種亞型—人體體細胞ACE（somatic ACE，sACE）和睪丸ACE（testis ACE，tACE），它們由同源的C-ACE和N-ACE組成，而tACE與sACE的C域相同，但sACE在其N端含有一個獨特的36-殘基序列。有研究表明，C域對于體內血壓的控制具有明顯作用[5]。腎素-血管緊張素系統（renin-angiotensin system，RAS）和激肽釋放酶-激肽系統（kallikrein-kinin system，KKS）在調節血壓和維持體液平衡方面發揮著重要作用。在RAS系統中，ACE通過將非活性形式的十肽-血管緊張素I（angiotensin I）轉化為一種強效的血管收縮劑八肽—血管緊張素II（Angiotensin II），血管緊張素II是一種有效的血管收縮劑，能使血壓上升[6]；在KKS系統中，ACE抑制了緩激肽的分解，緩激肽是一種血管舒張劑，可降低血壓，將緩激肽分解為一個無活性的片段，從而使血壓升高，ACE會通過雙重作用提高血壓，即刺激血管收縮和抑制血管舒張。

1.2 ACE抑制肽的研究簡史

ACE抑制肽的發現于1965年，FERREIRA S H[7]從蝮蛇體內發現緩激肽增強因子，1970年[8]，用超濾法在蝮蛇體內提取分離出9個具有增強緩激肽作用的肽段，每個肽段有5～13個氨基酸殘基，這些肽段在組成上相似，且脯氨酸含量較高，同時大多肽段含有谷氨酸、精氨酸和色氨酸。研究證明，這些多肽抑制循環激素如緩激肽和血管緊張素Ⅱ的失活和釋放。1971年，ONDETTI M A等[9]用固相合成法合成了緩激肽增強因子-壬肽抗壓素（teprotide），并將ACE抑制劑應用于臨床。1977年，CUSHMAN D W等[10]根據ACE底物的化學及分子動力學模型設計出ACE活性的結構模型，同年ONDETTI M等[11]根據已知的ACE模型的活性位點人工合成了新的抗高血壓藥物—卡托普利。隨著對血管緊張素轉換酶抑制劑的深入研究，又誕生了培哚普利、雷米普利、賴諾普利和曲多普利等ACE抑制劑，并被廣泛應用于高血壓的臨床試驗和治療。但經長期研究表明，部分患者服用人工合成ACE抑制劑后出現咳嗽、頭暈、疲勞、血管水腫，鉀水平升高等不良反應，長期服用對人體各器官產生毒副作用，而食源性ACE抑制肽具有成本低、無副作用的優點，有望成為理想的功能性食品。1979年，OSHIMA G等[12]采用細菌膠原酶水解明膠分離提純了食源性ACE抑制肽。1982年，MARUYAMA S等[13]從酪蛋白的水解液中分離提純出具有ACE抑制活性的肽段，這是首次從乳蛋白源中提取出ACE抑制肽，為后續乳源提取奠定了基礎。1995年，NAKAMURA Y等[14]采用瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）兩種混合菌株作為發酵劑，研制出具有ACE抑制活性的酸奶“Calpis”，并從中提取出了ACE抑制肽活性的短肽IPP（Ile-Pro-Pro）和VPP（Val-Pro-Pro）。經研究表明，水母性腺[15]，虹鱒魚[16]，蠶蛹蛋白[17]，乳清蛋白[18]等眾多食品中都可分離提取ACE抑制肽。因此，從食品中尋找ACE抑制肽并利用這些肽取代化學合成抑制劑已成為本研究領域的發展趨勢。

2 ACE抑制肽來源

2.1 植物來源ACE抑制肽

從植物中分離ACE抑制肽來源豐富、成本較低、分離及純化較為方便。MA F F等[19]采用液相二級質譜法從銀杏種子中分離得到三條多肽序列TNLDWY（Thr-Asn-Leu-Asp-Trp-Tyr）、RADFY（Arg-Ala-Asp-PheTyr）、RVFDGAV（Arg-Val-Phe-Asp-Gly-Ala-Val），其ACE的半抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50）分別為1.932 μmol/L、1.35 μmol/L和1.006 μmol/L，采用分子對接的方法進行了研究，結果表明，該多肽能與ACE緊密結合，并與S1、S2和S10活性位點的氨基酸殘基進一步相互作用。馬洪鑫等[20]采用直接加熱法從苜蓿葉提取出蛋白，分別用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶6種酶進行酶解，獲得酶解產物。通過篩選得木瓜蛋白酶ACE抑制率最高為（90.69±2.77）%，其最佳酶解工藝為pH值7.5，酶解時間4 h，酶解底物質量分數4%。SUN Z L等[21]用胰蛋白酶水解海棠從中分離和鑒定出以下3種ACE抑制肽：IGETGP（Ile-Gly-Glu-Thr-Gly-Pro），GATGPAGYV（Gly-Ala-Thr-Gly-Pro-Ala-Gly-Tyr-Val）和GAFGPGGLVGRP（Gly-Ala-Phe-Gly-Pro-Gly-Gly-Leu-Val-Gly-Arg-Pro），其ACE的IC50分別為19.07 μmol/L、27.42 μmol/L和31.26 μmol/L。LI M Q等[22]利用微波輔助酶法從堿性磷酸酶水解黑豆蛋白中提取ACE抑制肽，其多肽的ACE抑制活性為70.38%。余虹等[23]采用風味蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解龍須菜蛋白，最終篩選出胰蛋白酶為ACE抑制肽的適宜蛋白酶，抑制率為72.37%。

2.2 動物來源ACE抑制肽

動物來源ACE抑制肽以家畜、海洋生物和蛋類來源為主。MUGURUMA M等[24]采用凝膠滲透色譜法和反相高效液相色譜法從豬骨骼肌球蛋白中提取出兩種多肽KRVITY（Lys-Arg-Val-Ile-Gln-Try）和VKAGF（Val-Lys-Ala-Gly-Phe），ACE的IC50分別為6.1 μmol和0.3 μmol，經研究表明即使在烹調后，骨骼肌中的抗高血壓多肽仍具有ACE抑制活性。JIANG Z等[5]經堿性蛋白酶酶解琵琶魚中純化出兩條ACE抑制肽為TFPHGP（Thr-Phe-Pro-His-Gly-Pro）和HWTTQR（His-Trp-Thr-Thr-Gln-Arg），并采用分子對接與分子動力學模擬的方法，研究ACE抑制肽與其受體ACE的相互作用及兩條多肽復合物中的時間應力和結合能，發現氨基酸Glu384和Glu411是ACE抑制活性的關鍵殘基。JIANG S S等[25]采用Plastein反應對海參蛋白其進行改性，制備出活性高、穩定性好的ACE抑制肽，且X射線衍射（x-ray diffraction，XRD）譜圖在7.9°和13.6°處出現了兩個新的衍射峰，表明從肽中獲得新的產物，并且經過Plastein反應后肽的熱穩定性增強，肽的熱轉變溫度從120 ℃提高到134 ℃，ACE抑制肽水解產物活性也得到了提升。SUN S Q等[26]用5種不同的蛋白酶（胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、堿性蛋白酶）水解海洋大球藻從中提取出兩條新肽為FGMPLDR（Phe-Gly-Met-Pro-Leu-Asp-Arg）和MELVLR（Met-Glu-Leu-Val-Leu-Arg），其ACE的IC50值分別為219.35 μmol/L和236.85 μmol/L，采用分子對接方法發現，氫鍵與ACE的Zn2+的相互作用，對這兩種多肽的ACE抑制活性有一定的促進作用。KHUEYCHAI S等[27]采用陰離子交換層析法對鴕鳥蛋清中的卵清蛋白進行了純化，得到多肽YV，其ACE的IC50值為63.97 μg/mL，經分子對接后發現，YV的ACE活性主要歸因于YV與ACE的S1和S2口袋位點之間的氫鍵；經胃腸消化處理后發現，YV仍具有ACE抑制活性，且YV對人紅細胞、人角質形成細胞（HaCaT）和人肺成纖維細胞（MRC-5）均無毒副作用，所以，YV可用于新型降血壓產品的開發。

乳制品是ACE抑制肽的重要來源之一，而牛奶是乳中最常用的乳源提取物。ULUKO H等[28]采用中性酶解濃縮牛奶蛋白（MPC）從中提取出活性較高的ACE抑制肽，之后用分子質量8 kDa和3.5 kDa膜進行超濾以及0.2 kDa的膜進行納米過濾以產生4個組分，分析表明，3.5 kDa膜回收了大量的ACE抑制肽，且活性較高。MARTIN M等[29]使用胰蛋白酶水解乳清蛋白提取出具有ACE抑制肽活性的二肽LT（Lie-Trp），其ACE的IC50為0.7 μmol/L。研究表明，ACE抑制肽二肽IW（Ile-Trp）對自發性高血壓大鼠的血壓有明顯降低的作用，并且在臨床實驗中，單次口服50 mg IW制劑后，血漿ACE下降32%，因此，當高血壓患者服用后，IW可能會具有良好的效果。ALHAJ O A[30]用L.helveticus和L.acidophilus水解單峰駝駝乳，從中鑒定出多種多肽，但其C端位置為Tyr（Y）、Arg（R）和Pro（P）的多肽，具有較好的ACE抑制活性。PAMAR H等[31]研究發現發酵羊乳是一種新的ACE抑制肽來源，具有兩種潛在的乳酸菌培養物分別是干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）NK9和發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），羊乳在發酵過程中表現出良好的蛋白水解、ACE抑制活性和雙三肽酶活性。SAHINGIL D等[32]采用Lactobacillus casei、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus delbrueckiissp.和Lactobacillus plantarum發酵奶酪，經響應面分析法優化發現，成熟溫度為8～16 ℃，鹽分濃度為2.5%～3.0%，熟化期為43 d時，ACE抑制肽活性最高。

3 ACE抑制肽制備策略

生產制備ACE抑制肽的主要方法有四種[33]：（1）酶解法，分為直接酶解法和間接酶解法兩種。酶解法是通過酶分解蛋白質制備ACE抑制肽，是目前最為常用的方法。其優點是成本較低，安全性能高，無毒副作用。（2）化學合成法，分為液相和固相化學方法。化學合成法多用于人工合成藥物的制備，但其成本偏高，具有毒副作用和殘留化合物。（3）天然生物活性肽的直接提取，是直接從天然產物中提取ACE抑制肽，無需經過體外水解。（4）基因工程法，此方法適合生產蛋白質和長肽，但是ACE抑制肽幾乎都是短肽，因此基因工程法受到限制。

3.1 直接酶解法

酶解法是選用合適的酶水解蛋白質，從而使ACE抑制肽活性片段釋放。目前常用的酶有：堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶等。ZHENG Y等[34]采用堿性酶、風味酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶水解椰餅蛋白提取出具有ACE抑制肽活性的三條多肽：KAQYPYV（Lys-Ala-Gln-Tyr-Pro-Tyr-Val）、KIIIYN（Lys-Ile-Ile-Ile-Tyr-Asn）和KILIYG（Lys-Ile-Leu-Ile-Tyr-Gly）。采用超濾法、Sephadex凝膠層析法和反相高效液相色譜法對三種新型多肽進行分離，其ACE的IC50分別為37.06 mmol/L、58.72 mmol/L和53.31 mmol/L。PAN D等[35]使用胰蛋白酶水解乳清蛋白純化出具有ACE抑制肽活性的二肽LL（Leu-Leu）。經分子對接發現，抑制肽通過疏水作用與Ala354、Ala356、Phe391、Phe512、Val518殘基接觸，通過親水作用與His353、383、387、410、513、Glu384、411、Arg522殘基接觸。BINCY B等[36]使用胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶水解馬克面粉鑒定出具有ACE抑制肽活性的多肽TVGM TAKF（Thr-Val-Gly-Met-Thr-Ala-Lys-Phe）和QLLQQ（Gln-Leu-Leu-Leu-Gln-Gln），其ACE的IC50分別為30.3 μmol/L和75.0 μmol/L。YANG X X等[37]用堿性蛋白酶、中和酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶對蜜蜂蛹的多肽進行酶解篩選出具有ACE抑制活性的8個多肽，其中抑制活性較高的三個ACE抑制肽是AVFPSIVMGR（Ala-Val-Phe-Pro-Ser-Ile-Val-Gly-Arg）、PPVLVFV（Pro-Pro-Val-Leu-Val-Phe-Val）和PGKVIT（Pro-Gly-Lys-Val-His-Thr），其ACE的IC50分別為6.64 μmol/L、47.7859 μmol/L和223.869 μmol/L，此外，在模擬硅膠胃腸消化中，肽段AVFPSIVGR和PGKVHIT易被胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶分解，肽段PPVLVFV易被胃蛋白酶和糜蛋白酶分解。

3.2 發酵法

發酵法又稱間接酶解法[38]，是利用微生物代謝過程中產生的酶，水解發酵物中蛋白質，再從發酵液中提取具有ACE抑制活性的多肽。SHU G等[39]為提高發酵山羊乳的ACE抑制肽的產量，利用Lactobacillus bulgaricusLB6發酵羊奶，采用響應面法（response surface method，RSM）對發酵山羊乳中添加營養成分進行了研究，結果表明，最佳添加量為大豆蛋白胨0.35%、葡萄糖1.2%和酪蛋白0.15%時，ACE抑制率顯著提高。李利軍等[40]對采用微生物發酵的方法發酵調味品（醬油、黃豆醬、豆腐乳、食醋、甜面醬等）進行了綜合性概括，發現發酵調味品具有良好的ACE抑制活性，且調味品在日常生活中應用廣泛，具有很好的開發價值。SOLANKI D等[41]利用鼠李糖桿菌（L.rhamnosus）MTCC 5945（NS4）發酵駱駝乳提取出具有ACE抑制活性的多肽，研究發現多肽的氨基酸序列為MQTDIMIFTIGPA（Met-Gln-Thr-Asp-Ile-Met-Ile-Phe-Thr-Ile-Gly-Pro-Ala），ACE抑制肽源于αS1-酪蛋白。馬英輝等[42]以大豆分離蛋白為基質，通過微生物發酵法篩選出一株具有高ACE抑制活性的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BS90，當大豆蛋白含量為5%，初始pH 9，培養溫度35 ℃，培養時間為40 h時ACE抑制率高達81.8%，較優化前提高了13.4%。

3.3 固相合成法

固相合成是將索要合成多肽的氨基酸C端的羧基固定于不溶性的高分子樹脂，然后進行氨基酸縮合反應以延長肽鏈。ORIO L P等[43]以脫脂大麻籽為原料提取ACE抑制肽，采用Fmoc固相合成法合成了四種潛在的ACE抑制活性肽，即GVLY（Gly-Val-Leu-Tyr）、IEE（Ile-Glu-Glu）、LGV（Leu-Gly-Val）和RVR（Arg-Val-Arg），其中測得GVLY的ACE的IC50為（16±1.5）μmol/L、LGV為（145±13）μmol/L、RVR為（526±33）μmol/L。YANG S等[44]采用微波輔助固相合成法合成了14種新型ACE抑制劑，其中抑制活性最高的短肽為LAPF（Leu-Arg-Pro-Phe），其ACE的IC50為0.26 μmol/L，經分子對接發現，活性位點S1、S2口袋處多肽與tACE相結合，多肽與tACE結合的位點受肽C端L型或D型氨基酸構型的影響。HUANG M Y等[45]根據αS1-酪蛋白序列，采用Fmoc固相合成法合成三肽，通過高效液相色譜法檢測馬尿酸的濃度為0.005 mmol/L，篩選出與三肽抑制活性相對應的ACE抑制肽，結果表明，含有疏水氨基酸或脯氨酸的三肽與N端含有芳香氨基酸的三肽具有相同的抑制活性。MAHTA M等[46]從釀酒酵母蛋白水解液中分離出ACE抑制肽YGKPVAVPAR（Tyr-Gly-Lys-Pro-Val-Ala-Val-Pro-Ala-Arg），通過固相合成法得到YGKHVAVHAR（Tyr-Gly-Lys-His-Val-Ala-Val-His-Ala-Arg）、GKPVAVPA（Gly-Lys-Pro-Val-Ala-Val-Pro-Ala）、GKHVAVHA（Gly-Lys-His-Val-Ala-Val-His-Ala）和PAR（Pro-Ala-Arg）四種結構類似物，其ACE的IC50分別為（139.554±2.3）μmol/L、（61.91±1.2）μmol/L、（463.230±3.56）μmol/L、（135.135±2.1）μmol/L、（514.024±5.86）μmol/L，采用分子對接模擬發現肽序列與ACE通過氫鍵、疏水、親水和靜電相互作用結合。

4 ACE抑制肽活性檢測方法

4.1 體外活性檢測

體外活性檢測常采用以下方法，分光光度法、熒光法、放射化學法、高效液相色譜法和毛細管電泳方法。目前最常用的是CUSHMAN D W等[47]建立的紫外分光光度法，該方法以馬尿酰組氨酸亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL）作為基質，按照特定的順序依次加入定量的ACE和ACE抑制肽，經過反應后，用乙酸乙酯提取HHL后，使用紫外分光光度計在波長228 nm處測定HHL的最大吸光度。因為其設備及操作簡便，是目前實驗室最常用的檢測手段。色譜法在波長228 nm處用檢測器測吸光度值，其結果精度較高效液相色譜法準確，檢測過程更為快捷。

4.2 體內活性檢測

ACE抑制肽體內活性檢測是以動物實驗為主，一類是對原發性高血壓大鼠（sponta-neouslyhypertensive rats，SHR）為實驗對象，通過短期或長期的灌胃實驗，定期檢測實驗對象的血壓值，從而驗證ACE抑制肽的體內活性。第二類是對已麻醉的大鼠靜脈注射六甲銨藥物，之后注射ACE抑制肽，測量血壓判斷ACE抑制肽活性[48]。陶瑤等[49]采用中性蛋白酶水解枸杞提取出具有ACE抑制肽活性的酶解液，對服用卡托普利和枸杞蛋白酶的SHR大鼠與服用相等劑量生理鹽水大鼠相比，服降壓藥及枸杞蛋白酶的大鼠血漿AngⅡ含量均降低，心臟和腎臟組織中ACE信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）表達也降低，可以說明枸杞蛋白酶解液是通過抑制ACE的活性，減少AngⅡ的產生而達到降血壓的效果。BARKIA I等[50]采用4種蛋白酶（風味酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶）酶解天然海洋硅藻提取出具有ACE抑制肽的活性的多肽，給SHR大鼠每日口服400 mg/kg的硅藻水解物，5 d后其血壓下降了17 mmHg，證明硅藻水解物具有良好的ACE抑制活性。LIN Y H等[51]采用蛋白酶N1酶解小球藻（PN-1）提取出具有ACE抑制肽活性的多肽，ACE的IC50為0.035 mg/mL，采用粒度排除色譜法將PN-1分離為7個組分，ACE抑制肽的氨基酸序列分別為WV（Trp-Val）、VW（Val-Trp）、IW（Ile-Trp）和LW（Leu-Trp），其ACE的IC50分別為307.61 μmol/L、0.58μmol/L、0.50μmol/L和1.11μmol/L，SHR大鼠口服171.4mg的PN-1組分6 h后，收縮壓和舒張壓分別降低20 mmHg和21 mmHg。

5 存在的問題及前景分析

5.1 存在問題

越來越多食源性ACE抑制肽被研究，但大多數ACE抑制肽高活性結構并沒有得到確定，其結構特性與抑制肽的構效關系還需進一步研究。其次，ACE的制備及分離純化技術較為復雜，成本較高且難以批量生產。最后，體外活性檢測并不穩定，不能完全體現體內降血壓效果，因此還需進一步動物實驗進行驗證。

5.2 前景分析

高血壓是最嚴重的心血管死亡的原因，與大多數疾病不同，高血壓沒有癥狀，因此被稱為“無聲殺手”。然而，積極使用抗高血壓藥物并不是完全合理的，患者處于次優狀態。ACE抑制肽在血壓調節中起著至關重要的作用，近些年，國內外學者對ACE抑制肽進行開發與研究，越來越多的食物中提取出新型且抑制活性較高的ACE抑制肽。一些研究表明，食源性ACE抑制肽是可以被人吸收利用的，還可預防和治療多種疾病，因此，ACE抑制肽在世界范圍內受到更多的關注。隨著人們對ACE抑制肽的重視，新型食源ACE抑制肽設計的營養食品是一個很有前途的研究領域。